Методы лабораторной диагностики хламидийной инфекции при верхнечелюстных синуситах

Видео: Оториноларинголог Пониделко С. Н. (СМ Клиника)

I. Цитоскопический метод обнаружения хламидий

Предложено две методики, которые условно можно разделить на инвазивную и неинвазивную. Сущность первой состоит в том, что материалом для исследования является содержимое верхнечелюстных пазух, полученное во время пункции иглой Куликовского, которое после центрифугирования используют для приготовления мазков.

Вторая методика заключается в следующем: после анемизации полости носа 0,1 % раствором адреналина и аппликационной анестезии области среднего носового хода раствором дикаина 3 % — 0,3 мл, с помощью специальных одноразовых щеточек осуществляется забор материала вращательными движениями в течение 10—15 с между медиальной поверхностью средней носовой раковины и латеральной стенкой полости носа в области соустий околоносовых пазух. Полученный таким образом материал распределяется равномерно на предметном стекле, высушивается на воздухе и фиксируется в ацетоне в течение 10 мин при температуре 4—6 °С. Готовые мазки допускается хранить до момента исследования в течение 2 нед. при температуре 2—6 °С.

Окраска по Романовскому—Гимза. Краситель ex tempore разводится дистиллированной водой 1:10. Предметные стекла помещаются в чашки Петри на деревянные палочки препаратом вниз. Пространство между мазком и дном чашки заполняется красителем. Окрашивание проводится в течение 45 мин. Затем стекла тщательно промываются в проточной воде, просушиваются фильтровальной бумагой и дифференцируются в подкисленном спирте (к 100 мл 96 %-ного этанола добавляется 10 капель ледяной уксусной кислоты). После окраски препараты просматриваются в световом микроскопе с использованием иммерсионного объектива (х90). При этом цитоплазма клеток окрашивается в голубой цвет, ядра — в фиолетово-синий, цитоплазматические включения хламидий определяются в виде темно-синих или розовых микроколоний на фоне голубой цитоплазмы клеток. На стадии элементарных телец включения хламидий окрашиваются в розовый цвет, на стадии инициальных телец в синий (Пониделко С. Н., 2001). Для повышения информативности морфологического метода в исследованиях проводится подсчет количества нейтрофилов, лимфоцитов и макрофагов в приготовленных мазках до начала лечения и в динамике при воздействии вводимых препаратов.

II. Метод прямой иммунофлюоресценции

Мазки, приготовленные из соскобных материалов, а также мазки крови окрашиваются смесью взятых в рабочих разведениях иммуноглобулина флюоресцирующего поливалентного хламидийного и бычьего альбумина, меченного родамином для контрастирования фона. Используют рабочее разведение сывороток 1/20—1/40. Предметные стекла с исследуемым материалом и нанесенным красителем помещают во влажную камеру в термостат на 30 мин, после чего стекла извлекают и интенсивно промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2) на магнитной мешалке в течение 1 ч, меняя буфер через 30 мин. На высушенные мазки наносят 1 каплю забуференного глицерина (9 мл глицерина и 1 мл фосфатно-солевого буфера), после чего они покрываются покровным стеклом (Пониделко С. Н., 2001). Препараты просматривают под люминесцентным микроскопом «ЛЮМАМ-ИЗ». Учет результатов проводят визуально. Результаты исследования считаются положительными, если в препарате обнаруживаются морфологически типичные для хламидий элементы, специфически флюоресцирующие изумрудно-зеленым или желто-зеленым цветом:

• ретикулярные тельца хламидий (РТ) и скопления хламидий в цитоплазме в виде микроколоний, имеющих вид компактных, диффузно окрашенных образований различного размера — от 0,25 до 1,5 мкм;
• элементарные тельца хламидий (ЭТ) — образования, находящиеся преимущественно за пределами клеток, сферической или овоидной формы, имеющие четко выраженный окрашенный периферический ободок в виде замкнутого кольца или полукольца размерами 0,25—0,5 мкм;
• межклеточно расположенные включения — большие ярко-зеленые пятна, образованные располагающимися близко друг от друга ЭТ.

III. Серологические методы

Кровь в объеме 2,5—3,0 мл у обследуемых забирают натощак из локтевой вены в сухую центрифужную пробирку. Пробирку с кровью в целях лучшей ретракции сгустка форменных элементов выдерживают в термостате при 37 °С в течение 40—45 мин. После термостатирования пробирку центрифугируют 20 мин при 3000 об./мин, сгусток «обводят», а пробирку помещают на 1 ч в холодильник, после чего, пользуясь пастеровской пипеткой, сыворотку отделяют от осадка. Сыворотки доставляют в лабораторию в течение ближайших 1,5—2 ч либо хранят при температуре 4—6 °С в течение 1—3 сут. Отдельные образцы сывороток допустимо содержать в морозильной камере холодильника при температуре минус 20—40 °С до проведения серийных исследований в течение срока, не превышавшего 6 мес.

Наиболее специфичной и информативной (90 %) считается реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Выявление антител к хламидиям только в одной пробе сыворотки даже при показателях их титра 1/8—1/16 может свидетельствовать как о вероятности текущей хламидийной инфекции, так и о наличии следовой реакции, связанной с любым заболеванием хламидийной этиологии, перенесенным в прошлом. Нарастание хламидийных антител в титрах 1/64—1/256 и выше даже в одной пробе сыворотки при длительно текущих и осложненных формах инфекции отражает предельное нарастание гуморальной реакции макроорганизма и при соответствующих результатах клинико-эпидемиологического анализа, а также анамнестических данных приобретает диагностическое значение.

Непрямой метод иммунофлюоресценции позволяет проводить идентификацию хламидий до вида при наличии соответствующих тест-объектов и титровании сывороток по отношению к конкретным видам возбудителей, также дает возможность оценить содержание в сыворотках отдельных классов иммуноглобулинов при наличии коммерческих флюоресцирующих Ig М, A, G. Отрицательные результаты серологических тестов не исключают наличия острой или хронической (персистирующей) хламидийной инфекции (Пониделко С. Н., 2001).

С помощью РНИФ у больных верхнечелюстными синуситами определяют титр антихламидийных антител в сыворотке крови. В качестве антигенных препаратов используются приготовленные на разграфленных предметных стеклах мазки из микробных суспензий, зафиксированные в течение 30 мин охлажденным ацетоном. Материалом для мазков служат смеси суспензий из желточных мешков куриных эмбрионов или из органов белых мышей, инфицированных С. trachomatis, С. pneumoniae и С. psittaci.

Такие антигенные препараты, обладая специфичностью на уровне рода, обеспечивают выявление антихламидийных антител (AT) ко всем эпидемиологически значимым видам хламидий. Исследуемые сыворотки в разведении от 1 : 2 до 1 : 256 наносят на мазки, стекла помещают во влажную камеру и термостатируют при 37 °С в течение 15—20 мин. После экспозиции исследуемый материал смывают струей водопроводной воды, стекла погружают в батарейный стаканчик с фосфатно-солевым буфером рН 7,2—7,4, а затем ополаскивают дистиллированной водой. После подсушивания при комнатной температуре на мазки наносят взятый в рабочем разведении кроличий античеловеческий люминесцирующий иммуноглобулин и, поместив стекла во влажную камеру, термостатируют при температуре 37 °С в течение 15—20 мин. Затем окрашивающую смесь удаляют, стекла отмывают в фосфатно-солевом буфере рН 7,2—7,4 в течение 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Микроскопию окрашенных препаратов осуществляют с помощью люминесцентного микроскопа. Интенсивность специфической флюоресценции в препаратах оценивают по общепринятой четырехкрестовой шкале (Пониделко С. Н., 2001):

«++++» — яркая флюоресценция изумрудно-зеленого цвета, вокруг ЭТ отчетливо видны светящиеся «ободки»;

«+++» — достаточно яркая флюоресценция желто-зеленого цвета, периферические «ободки» у ЭТ могут выявляться;

«++» — слабая флюоресценция, морфологически возбудитель выявляется достаточно четко, но периферические «ободки» у ЭТ едва различимы;

«+» — слабая флюоресценция, цвет неопределенный, морфология объекта микроскопии различима плохо.

За диагностически-значимый титр антихламидийных антител принимают максимальное разведение сыворотки, обеспечивающее специфическое окрашивание не менее чем на «++». При оценке серологической активности сывороток в отношении хламидийных антигенов за диагностически значимые принимают титры 1 : 8 и выше.

IV. Метод полимеразно-цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была впервые описана в 1985 г. и стала стандартным методом амплификации ДНК во многих молекулярно-биологических лабораториях. Основу методики составляют повторяющиеся циклы направляемого олигонуклеотидами синтеза ДНК, приводящие к репликации in vitro нуклеотидных последовательностей мишени. В результате амплификации может образоваться 1 млрд копий ДНК-мишени, которые можно обнаружить либо с помощью электрофореза в геле, либо методом гибридизации со специфичным зондом с последующим выявлением гибридов методом иммуноферментативного анализа (ИФА). ПЦР имеет высокую видовую специфичность и чувствительность до 10 молекул ДНК (Пониделко С.Н., 2001).

После забора материала по указанным выше методикам с помощью одноразовых специальных щеток он помещается в стерильные пробирки емкостью 2 мл (эпиндорфы) в заранее приготовленный буфер (0,9 % раствор натрия хлорида). Материал в течение 2 ч транспортируется в лабораторию или после замораживания до температуры минус 18 °С сохраняется в течение длительного времени до проведения исследования.

Результат анализа считают положительным, если:

• размер ДНК-продукта в клиническом образце точно соответствует ДНК-продукту контрольной пробы;
• в пробе, содержащей клинический образец и внутренний стандарт, идентифицируется специфический ДНК-продукт внутреннего стандарта;
• в пробе, содержащей вместо клинического образца воду (отрицательный контроль), ДНК-продуктов не обнаруживается.

Результат анализа считают отрицательным, если:

• в пробе, содержащей клинический образец, специфических ДНК-продуктов не обнаруживается;
• результаты ПЦР в обеих контрольных пробах специфических ДНК-продуктов не обнаруживают.

Анализ повторяют, если:

• в пробе, содержащей контрольную ДНК, специфических ДНК- продуктов не обнаруживается;
• в пробе с внутренним стандартом специфических ДНК-продуктов не обнаруживается, а в отрицательном контроле обнаруживается специфический ДНК-продукт.

V. Культуральный метод выделения хламидий

Выделение возбудителя на культурах клеток (КМ), обработанных предварительно различными антиметаболитами, является одним из лучших методов диагностики хламидиозов, так называемый «золотой стандарт».

Материал забирают как и для прямого иммунофлюоресцентного метода (ПИФ) специальными стерильными щеточками. Взятый материал помещается в транспортную среду. В качестве транспортной среды используют фосфатный буфер с сахарозой, к которому перед использованием добавляют инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота из расчета 4 % от общего объема, стрептомицин 50 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл среды. Доставка материала в лабораторию осуществляется (в термосе со льдом) не позже 2 ч с момента забора. Культуральные исследования проводят с использованием культуры клеток LLC + MR2 + L929 + ВНК-21С с искусственно сниженной резистентностью. Забранный материал наслаивают на монослои культуры клеток, выращенные на покровных стеклах, предварительно слив ростовую среду. Затем зараженная клеточная культура помещается во флаконы и центрифугируется в течение 1 ч при 3000 об./мин, что увеличивает число внутриклеточных включений. После центрифугирования материал сливают в пробирки, куда добавляют изолирующую среду «Игла» (Eaglas MEM) с циклогексамидом в концентрации 2 мкг/мл. Пробирки инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 48—72 ч (время соответствует циклу развития хламидий), после чего покровные стекла с монослоем достают из пробирок, укладывают на предметные стекла монослоем вниз в канадском бальзаме и определяют включения возбудителя. Перед этим проводится фиксация и окраска мазков флюоресциирующими антителами, а результаты оцениваются через 48—72 ч методом ПИФ (с использованием специфических поликлональных и моноклональных антител). При получении отрицательных результатов производят новый посев (пассаж) материала. Инфицирование клеточного монослоя и оценку результатов осуществляют по стандартной методике.

Метод диагностического выделения хламидий в культуре клеток необходимо использовать в течение всего периода заболевания, за исключением периода антибиотикотерапии, а также в течение 2—3 мес. после него. Для контроля излеченности с целью выявления жизнеспособных хламидий, которые могут осуществлять свой полный цикл развития, используют данный метод через 3 мес. после окончания лечения.

VI. Метод электронной микроскопии

С целью диагностики персистентных форм хламидийной инфекции при верхнечелюстных синуситах используют метод электронной микроскопии. Проводится исследование биопсийного материала слизистой оболочки полости носа и пазух. Для этого участки слизистой сразу после забора фиксируются в 2,5 %-м глютаровом альдегиде на 0,1 молярном какодилатном буфере при рН 7,4 в течение 2—24 ч. После 3-кратной промывки в какодилатном буфере дофиксируются 1 % раствором четырехокиси осмия в течение 1,5—2 ч. Далее проводится обезвоживание препарата в спиртах восходящей концентрации по 15—20 мин и пропитка смолой в виде смеси эпона с аралдитом. В заключение проводится полимеризация в термостате в течение 3 сут. при температуре 37 и 60 °С. После полимеризации готовят полутонкие срезы до 1 мк толщиной на ультратоме LKB-3 (Швеция). Окраска срезов осуществляется по методике, предложенной С. D. Humphrey, F. Е. Pittman (1974), метиленовым синим, азуром-2 и основным фуксином для предварительного просмотра и анализа под световым микроскопом (Пониделко С. Н., 2001). Одновременно производится фотосъемка с помощью фотомикроскопа «Opton» (ФРГ). Затем готовят ультратонкие срезы толщиной 3700 ангстрем, помещают их на медные сетки размером 200 МЕЖ, после этого контрастируют насыщенным 30 % раствором этилового спирта и цитратом свинца (по Рейнольдсу). Срезы исследуют под электронным микроскопом «JEM 100S» (Япония) при ускорении напряжения 80 кВ, при увеличении х5, х10, х30, х50 тысяч раз. Для фотографий используется пленка типа ФТ-41п (Россия).

Для диагностики хламидийного поражения околоносовых пазух необходимо использовать специальный диагностический алгоритм.

Основным принципом диагностического поиска является его трехэтапность.

На первом этапе проводится скрининговое исследование сыворотки крови больных синуситами для обнаружения антихламидийных антител, свидетельствующих о текущей инфекции с помощью ИФА и РНИФ, а также верификация хламидий по видам (С. pneumoniae, С. trachomatis, C.psittaci).

На втором этапе с помощью ПИФ и ПЦР осуществляется диагностика хламидий непосредственно в очагах (полости носа и околоносовых пазух) и лейкоцитах периферической крови с целью установления генерализации инфекции.

На третьем этапе диагностики с помощью КМ определяют антибиотикочувствительность возбудителей.

Данный алгоритм апробирован при обследовании 97 пациентов, из которых лица с хроническими верхнечелюстными синуситами составили 28 человек, 39 пациентов были с острыми рецидивирующими верхнечелюстными синуситами и 30 — не страдали заболеваниями ЛОР-органов и вошли в контрольную группу. Сравнительная информативность различных методов лабораторной диагностики хламидийной инфекции среди обследованных данных групп представлена в таблице.

Сравнительная информативность различных методов лабораторной диагностики хламидийной инфекции при синуситах

Метод	Хламидийная инфекция
	С. pneumoniae	С. trachomatis	С. psittaci	Всего
ПИФ	59 (60,7 %)
ПЦР	35 (36 %)	8 (8,2 %)	-	43 (44,3 %)
КМ	31 (31,9 %)	11 (11,3%)	-	42 (43,2 %)
РНИФ	25 (25,7 %)	14 (14,4 %)	7 (7,2 %)	46 (47,3 %)

Как видно из представленных данных, в исследуемых материалах от больных хламидии диагностированы с помощью поликлональных группо-специфических антихламидийных антител у 59 (60,7 %) человек. Однако использование других методов диагностики позволило провести их полную идентификацию. При этом установлена примерно равная частота обнаружения С. pneumoniae и С. trachomatis в материалах от больных синуситами (ПЦР — 44,3 %, КМ - 43,2 %, РНИФ - 40,2 %).

Таким образом, полученные результаты сравнительного изучения методов диагностики хламидийной инфекции выявили высокую частоту обнаружения хламидий при верхнечелюстных синуситах, что позволяет использовать определение «синусит хламидийной этиологии» и выделить ряд клинических особенностей, характерных для данной группы заболеваний.


"Заболевания, повреждения и опухоли челюстно-лицевой области"
под ред. А.К. Иорданишвили