Микробиологический метод лабораторной диагностики инфекционных болезней

После получения результатов обследования и с учетом эпидемиологических данных устанавливают заключительный диагноз. В диагнозе указывают нозологическую форму, шифр по МКБ-10, метод подтверждения диагноза, тяжесть и особенности течения болезни, период болезни, наличие осложнений и сопутствующих заболеваний, например: «Брюшной тиф (гемокультура), тяжелое течение болезни, период разгара- осложнение — кишечное кровотечение- сопутствующее заболевание — сахарный диабет». Максимально точно сформулированный и подробный диагноз определяет терапевтическую тактику.

В ряде случаев, когда клинических данных недостаточно, а лабораторные исследования не позволяют установить этиологию болезни, допускается постановка синдромного диагноза (например, пищевая токсикоинфекция, острое респираторное заболевание, ОРВИ).

Лабораторные исследования играют важную роль в установлении диагноза инфекционных болезней, назначении этиотропной терапии, проведении контроля за эффективностью лечения. Процесс специфической лабораторной диагностики основан на выявлении возбудителя и ответной реакции организма человека в ходе инфекционного процесса. Он состоит из трех этапов: сбора материала, транспортировки и его исследования в лаборатории. К проведению каждого этапа предъявляют определенные требования, от соблюдения которых зависит эффективность лабораторной диагностики. Задача врача заключается в правильном выборе метода исследования и грамотной оценке его результатов.

Лабораторные методы диагностики различны по чувствительности и специфичности. Чувствительность метода отражает вероятность того, что результат теста будет положительным у инфицированного пациента и определяется отношением общего числа положительных результатов к общему числу инфицированных пациентов. Чем выше чувствительность теста, тем меньше вероятность получения ложноотрицательных результатов. Критерий специфичности отражает вероятность того, что результат теста будет положительным у неинфицированного пациента, и его вычисляют как отношение общего числа отрицательных результатов к общему числу неинфицированных пациентов. Чем меньше специфичность, тем больше вероятность получения ложноположительных результатов. Оба показателя выражают в процентах.

Микробиологический метод диагностики основан на обнаружении возбудителей в биологическом материале. Используют светооптическую и электронную микроскопию.

Микробиологический метод широко применяют в диагностике инфекционных болезней бактериальной, протозойной этиологии и, реже, вирусных болезней.

В практике работы бактериологической лаборатории микроскопическое исследование в большинстве случаев имеет значение ускоренной ориентировочной диагностики. Основными задачами микроскопии служат выявление возбудителя в клиническом материале, ориентировочная идентификация на основании определения характерных морфологических и тинкториальных признаков бактерий, а также изучение окрашенных мазков из колоний чистых культур.

Материалом для микроскопического исследования могут быть кровь, костный мозг, ликвор, пунктаты лимфатических узлов, фекалии, дуоденальное содержимое и желчь, моча, мокрота, отделяемое мочеполовых путей, биоптаты тканей, мазки со слизистой оболочки ротовой полости, небных миндалин, носа и др.

Для обнаружения «кровепаразитов», например простейших (малярийные плазмодии, трипаносомы, лейшмании, бабезии) и гельминтов (микрофилярии), исследуют препараты «тонкий мазок» и/или «толстая капля» крови.

Препарат «толстая капля» готовят двумя способами:

Подсыхать «толстые капли» должны постепенно на воздухе, без подогрева, в условиях защиты их от повреждения насекомыми. Препараты крови окрашивают без предварительной фиксации по Романовскому—Гимзе.

Для приготовления тонкого мазка делают отпечаток крови вблизи края предметного стекла, затем ребром под углом 45° подводят к капле шлифованное стекло и после растекания крови вдоль его края непрерывным движением распределяют кровь по поверхности предметного стекла. Полученный препарат фиксируют и окрашивают.

Спинномозговую жидкость для микробиологического исследования отбирают в стерильную пробирку во время люмбальной пункции. Для приготовления препарата используют осадок, образующийся спонтанно или в результате центрифугирования.

Мазки со слизистой оболочки ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном, мазок-отпечаток готовят на предметном стекле. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают стерильным ватным тампоном, который вводят вглубь полости носа. Мазок из носоглотки берут стерильным заднеглоточным тампоном, вводя его осторожно через носовое отверстие в носоглотку. Для проведения анализов на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки. Материал из носа и глотки берут разными тампонами.

Мочу для микроскопического исследования собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Для приготовления препарата используют осадок мочи.

Микроскопическому исследованию подвергают нативные (нефиксированные, неокрашенные) и окрашенные препараты. В первом случае выявляют живые микроорганизмы в препарате «висячая капля» или «раздавленная капля», оценивая подвижность и морфологические свойства возбудителя. Например, темнопольную микроскопию нативных препаратов используют для диагностики спирохетозов (первичного сифилиса, лептоспироза, эпидемического (вшиного) возвратного тифа), кандидоза или других грибковых заболеваний. В этих случаях результат микроскопического исследования дает основание для постановки диагноза.

Наиболее широко применяют микроскопию микроорганизмов в окрашенном состоянии, в частности для диагностики паразитарных болезней (малярия, амебиаз, лямблиоз, лейшманиоз, гельминтозы). Для окраски препаратов используют ориентировочные, специальные и дифференцирующие методы. Ориентировочная окраска позволяет оценить общую морфологию микроорганизма. С этой целью применяют стандартные красители — фуксин или метиленовый синий.

Среди специальных методов наиболее часто используют окраску по Граму. Этот метод выявляет способность бактерий удерживать краситель кристаллический фиолетовый (или генциановый фиолетовый) либо обесцвечиваться в спирте. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный, так как они обесцвечиваются в спирте и их дополнительно окрашивают фуксином. Окраска возбудителей по Граму позволяет определить первичный выбор средств антибактериальной терапии.

К специальным методам относят окраску по Цилю—Нильсену, выявляющую кислото- и спиртоустойчивые палочки, в частности микобактерии туберкулеза, которые окрашиваются в красный цвет, а остальные микроорганизмы — в синий.

Дифференцирующими называют методы окраски отдельных элементов бактериальной клетки. Например, окраска метахроматиновых (волютиновых) включений в бактериях (по Нейссеру, Майеру), окраска капсул (по Гиссу, Лейфсону, Антони), спор, жгутиков (по Леффлеру, Бейли, Грею и др.), клеточной стенки, хроматиновых (ядерных) элементов (по Романовскому—Гимзе и Пекарскому).

К микроскопическим методам исследования относят иммунофлюоресценцию (люминесцентная микроскопия), используемую для диагностики бактериальных и вирусных инфекций и основанную на применении антител, меченных флюоресцирующим красителем.

Эффективность микроскопического метода определяется его чувствительностью и специфичностью. Специфичность ограничивается возможной ошибочной идентификацией возбудителя из-за артефактов. Кроме того, при проведении микроскопического исследования имеют значение техника исследования- например, при диагностике малярии чувствительность исследования крови методом «толстой капли» в 20—40 раз выше, чем при исследовании методом тонкого мазка, поскольку данный препарат позволяет просматривать больший объем крови, а кроме того, плазмодии в препарате располагаются внеклеточно, что облегчает их обнаружение и количественную оценку.

Тем не менее чувствительность метода «толстой капли», проводимого по стандартам ВОЗ (исследование минимум 100 полей зрения в течение минимум 5 мин), все же не превышает 95 % из-за неравномерности распределения малярийных плазмодиев крови, особенно при низком уровне паразитемии.

Важным способом повышения чувствительности микробиологического метода является использование различных способов концентрации патогенов, например осаждение или флотация пробы при исследовании кала и фильтрация через миллипоровые фильтры проб крови, мочи, спинномозговой жидкости.

Повышению эффективности микроскопического исследования способствует количественное определение выявленного паразита в поле зрения или единице объема исследуемого материала. В частности, при малярии (особенно при обнаружении Р.Гакпрагит) важно определение интенсивности паразитемии.

Количественная оценка микрофлоры в мазке, а также выявление микробных ассоциаций важны в случае необходимости определения этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. Известно, что максимальная определяемая концентрация бактерий в мазке из нативного материала составляет 10  клеток в 1 мл. Для большинства видов исследуемого материала этиологически значимым считается обнаружение условно-патогенных бактерий определенного вида в концентрации не менее 10 —10  клеток в 1 мл, поэтому чувствительность микроскопического метода в большинстве случаев удовлетворяет потребностям клинической микробиологии.

Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.