Онкология-

Б.П.Копнин

Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

источник RosOncoWeb.Ru

01 0203 0405 0607
3.3. р53 - многофункциональный опухолевый супрессор, чаще всегопоражаемый в различных новообразованиях человека

3.3.1. Типы опухолей, ассоциированные с аномалиями р53

Наиболее универсальным молекулярным изменением в различных новообразованияхчеловека является инактивация функции белка р53. Более чем в половиневсех опухолей человека (50-60% новообразований более чем 50 различныхтипов) обнаруживаются мутации гена р53. В отличие от других опухолевыхсупрессоров, для которых характерны мутации, прекращающие синтезбелка (делеции, образование стоп-кодонов, сдвиг кодирующей рамки,нарушения сплайсинга мРНК), подавляющее большинство (более 90%)мутаций р53 представляет собой миссенс-мутации, приводящие к заменеодной из аминокислот в белковой молекуле на другую. Еще однойособенностью мутаций р53 в опухолевых клетках является то, чтоони, в отличие от мутаций других опухолевых супрессоров, частоявляются гетерозиготными, т.е. поражают только один из двух аллелейгена. (Причины этих различий будут раскрыты ниже, при рассмотренииструктурной организации и функций р53 - см. раздел 3.3.2.)

Мутации обнаруживаются в разных участках молекулы р53, но чащевсего в его эволюционно консервативном ДНК-связывающем домене,причем с наибольшей частотой в кодонах 175, 245, 248, 249, 273и 282 (так называемые горячие точки) - см. Рис. 2. Интересно,что спектр мутаций несколько меняется в зависимости от гистогенезаопухоли и/или этиологического фактора. Например, мутации в кодоне175 не встречаются в опухолях легких, а замены в другой горячейточке - кодоне 273 - не обнаруживаются при бластном кризе хроническогомиелоидного лейкоза. В то же время для раков легкого характернымутации в кодоне 145, очень редко встречающиеся в других новообразованиях,а мутации в кодоне 249 обнаруживаются преимущественно в гепатокарциномах,вызванных специфическим канцерогеном - афлатоксином В. Очевидно,отражением действия канцерогенов с разными механизмами мутагенногодействия являются и отличия в характере мутаций р53 в разных опухолях.Так, при опухолях лёгких, печени и лимфомах замена аминокислотныхостатков в большинстве случаев обусловлена трансверсиями (в ДНКпуриновый нуклеотид заменен на пиримидиновый или наоборот), апри карциномах кожи, лимфоме Беркитта, Т-клеточном лейкозе - транзициями(заменой пуринового основания на другое пуриновое или пиримидиновогона другое пиримидиновое).

Герминальные (произошедшие в половой клетке и передающиеся понаследству) мутации в одном из аллелей гена р53 вызывают синдромЛи-Фраумени, заключающийся во врожденном предрасположении к развитиюразличных новообразований, в первую очередь сарком, рака молочнойжелезы, лимфолейкозов. Нередко синдром Ли-Фраумени характеризуетсявозникновением первично-множественных опухолей. Примечательно,что у трансгенных мышей, несущих инактивирующие мутации в генер53, наблюдается картина, очень напоминающая синдром Ли-Фраумени.Примерно у трети животных, у которых инактивирован один из двухаллелей р53, в течение 6-9 месяцев после рождения возникают новообразования,причем их спектр очень сходен с наблюдаемым при синдроме Ли-Фраумени.При этом в части этих опухолей, как и новообразований у пациентовс синдромом Ли-Фраумени, сохраняется экспрессия неповрежденногоаллеля гена р53. При врожденной инактивации во всех клетках организмаобоих аллелей гена р53 опухоли развиваются практически у всехживотных. Примерно такая же картина наблюдается у трансгенныхмышей, несущих дополнительный экзогенный аллель р53, кодирующийбелок с миссенс-мутацией.

Важно подчеркнуть, что мутации - не единственный путь нарушенияфункции белка р53 в опухолевых клетках. Так, для 10-20% рака молочнойжелезы, а также для нейробластом характерно нарушение транспортар53 из цитоплазмы в ядро, где он проявляет свою функциональнуюактивность. В части остеосарком наблюдается амплификация клеточногоонкогена MDM2, продукт которого связывает и инактивирует белокр53 (см. раздел 3.3.3). При раке шейки матки, ассоциированномс вирусами папиллом человека, происходит связывание р53 с вируснымонкобелком Е6), что вызывает деградацию белка р53, и т.д.

3.3.2. Структурная организация и биохимические активности белкар53

Продукт гена р53 имеет мол. массу 53кДа и состоит из 392 аминокислотныхостатков. Он образует тетрамерный комплекс, способный регулироватьтранскрипцию ряда генов, имеющих в своем составе специфическиепоследовательности ДНК, так называемые р53-респонсивные элементы.В молекуле р53 картировано несколько функционально-значимых доменов,играющих важную роль в осуществлении или регуляции его активности(Рис. 2).

N-концевой участок (аминокислоты 1-42) представляет собой домен,ответственный за транскрипционную активацию генов-мишеней. Онобладает способностью связываться с компонентами базальных факторовтранскрипции, в частности с субъединицами hTAFII31, hTAF70 комплексаTFIID РНК-полимеразы II, а также с транскрипционным кофакторомp300/CBP. Кроме того, этот домен участвует в белок-белковых взаимодействиях,регулирующих стабильность молекулы р53. И, наконец, в нем расположенонесколько остатков серина и треонина, фосфорилирование которыхрегулирует активность р53.

Рис. 2. Схематическое изображение функциональных доменов р53,предполагаемой модели приобретения белком транскрипционно активнойконформации и частоты встречаемости в новообразованиях человекамутаций в разных участках молекулы р53.

Центральный домен р53 (аминокислоты 120-290) непосредственноузнает и связывает специфические последовательности ДНК регулируемыхгенов, так называемые р53-респонсивные элементы, состоящие израсположенных друг за другом последовательностей с обобщеннойструктурой типа PuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy (Pu - пурин, Py - пиримидин).Именно в этом ДНК-связывающем домене локализуется большинствоточечных мутаций, обнаруживаемых в различных опухолях человека(Рис. 2).

Далее идут участки ответственные за ядерную локализацию (аминокислоты305-323) и димеризацию/тетрамеризацию молекул р53 (аминокислоты323-356). С-концевой участок р53 (аминокислоты 363-392) представляетсобой так называемый ингибиторный домен. В немодифицированномсостоянии он препятствует посадке ДНК-связывающего домена на специфическуюпоследовательность регулируемого гена. Фосфорилирование и ацетилированиеего определенных сайтов вызывают изменения конформации белковоймолекулы и переход тетрамеров р53 из неактивного (латентного)состояния в активное. В результате ДНК-связывающие домены освобождаютсяот блокирующего влияния ингибиторных доменов и приобретают способностьсадиться на р53-респонсивные элементы. Таким образом, к респонсивнымгенам привлекаются базовые факторы транскрипции, связывающиесяс N-концевым участком р53, и стимулируется синтез РНК генов-мишеней.

Помимо повышения транскрипции генов, содержащих специфическиереспонсивные элементы, белок р53 обладает также и рядом другихактивностей. В частности, он способен подавлять транскрипцию многихдругих генов, например протоонкогенов BCL2, JUN и FOS, гена фибронектинаи т.д. В основе такой транс-репрессии лежит несколько механизмов:связывание и секвестрация активированным р53 ряда базовых факторовтранскрипции (p300/CBP, TBP, CBF)- способность связывать и рекрутироватьк определенным генам гистоновые деацетилазы (HDAC), ремоделирующиехроматин- и т.д. Кроме того, р53 связывается с белками, вовлеченнымив репликацию или репарацию ДНК и, как следствие, модулирует этипроцессы. Так, взаимодействуя с белком RP-A, он ингибирует егоспособность активировать ДНК-полимеразы a и d, результатом чегоявляется подавление репликации ДНК. Связывая компоненты комплексаTFIIH (ERCC2, ERCC3 и др.), р53 активирует его функцию и стимулируеттем самым эксцизионную репарацию ДНК. Связывание р53 с белкомRad51 ведет к стимуляции рекомбинаций ДНК и повышению эффективностирепарацию двунитевых разрывов ДНК. На участие р53 в репарацииДНК указывает также и его способность проявлять активность 3`-5`-экзонуклеазыи узнавать участки одноцепочечной ДНК и/или неспаренные основания.

Рис. 3. Схематическое изображение различных конформационных состоянийр53, распознаваемых специфическими антителами. Онкогенные мутациивызывают необратимый переход молекулы в денатурированное состояние,при котором открывается ранее недоступный эпитоп и, наоборот,исчезают некоторые ранее доступные эпитопы.

Характерные для опухолевых клеток миссенс-мутации приводят крезкому изменению конформации молекулы белка р53 (Рис. 3), чтов значительной степени затрагивает все из вышеуказанных его активностей:происходит потеря или ослабление способности связывать и активироватьгены с р53-респонсивными элементами, репрессировать другие специфическиегены-мишени, ингибировать репликацию ДНК и стимулировать репарациюДНК. Причем, так как р53 образует тетрамерные комплексы, мутациив одном аллеле гена р53 вызывают инактивацию и продукта второго,неповрежденного аллеля. Дело в том, что коэкспрессирующиеся нормальныйи мутантный белок р53 образуют неактивные гетеромерные комплексы.Таким образом, мутантный белок ингибирует функции нормальногобелка р53 по доминантно-негативному механизму. По-видимому, именноэта особенность мутантных р53 в значительной мере ответственназа их онкогенный потенциал. В пользу этого свидетельствует тотфакт, что введение в клетки короткого полипептида, соответствующегоолигомеризационному домену р53, нарушает образование полноценныхтетрамерных комплексов р53 и вызывает опухолевую трансформацию.Необходимо заметить, что помимо утраты нормальных функций р53,мутантные р53 с аминокислотными заменами в горячих точках (кодоны175, 248 и др.) приобретают новые свойства, не свойственные белкур53 дикого типа (gain-of-function). Так, описано приобретениемутантными р53 способности активировать промоторы протоонкогеновMYC и ERB1, антиапоптотического гена BGL1 из семейства Bcl2, генаMDR1, детерминирующего множественную лекарственную устойчивостьклеток и т.д. Предполагается, что это обусловлено способностьюнекоторых мутантных р53 связывать белки, в частности другие факторытранскрипции, с которыми нормальный р53 не взаимодействует, имодифицировать экспрессию генов, регулируемых этими транскрипционнымифакторами.

3.3.3. Физиологические функции р53 и их нарушения в неопластическихклетках

Молекулы белка р53 могут находиться в различных конформационныхсостояниях, в которых они обладают разными биохимическими активностямии выполняют разные физиологические функции. В обычных условияхр53 находится в так называемой латентной форме, в которой он обладаетслабой транскрипционной активностью. Такой р53, однако, связываетбелки репарационной машины (см. выше), проявляет активность 3`-5`-экзонуклеазыи стимулирует рекомбинацию и репарацию ДНК. При различных стрессахи внутриклеточных повреждениях происходят пост-трансляционныемодификации, в частности фосфорилирование и ацетилирование определенныхаминокислот молекулы р53, определяющие ее переход в так называемуюстрессовую конформацию. Такой р53 значительно более стабилен (т.е.резко увеличивается его количество в клетке) и эффективно транс-активируети/или транс-репрессирует специфические гены-мишени, следствиемчего является индукция в аномальных клетках либо остановки клеточногоцикла, либо апоптоза. Кроме того, активация р53 ведет к изменениюэкспрессии генов некоторых секретируемых факторов, в результатечего может изменяться размножение и миграция не только поврежденной,но и окружающих клеток. При этом, находясь в стрессовой конформации,р53 в значительной степени утрачивает активности, стимулирующиерекомбинацию и/или репарацию ДНК.

р53 дикого типа, в дополнение к латентной и стрессовой, можетвременно приобретать и так называемую мутантную конформацию, сходнуюс той, в которую молекула р53 необратимо переходит при онкогенныхмутациях. Транзиторный переход р53 в мутантную конформацию происходитпри воздействии определенных цитокинов и/или морфогенов (PDGF,тромбопоэтин, ретиноевая кислота и др.). Биологический смысл такогоперехода пока неясен. Возможно, он заключается в полной инактивациирост-ингибирующих активностей р53 и/или изменении набора его генов-мишеней.

Таким образом, р53 играет важную охранную роль, являясь по образномувыражению D.Lane, "стражем генома". Его повседневнаяфункция заключается, по-видимому, в распознавании и исправленииошибок, неизменно возникающих в ходе репликации ДНК. При массивныхповреждениях ДНК, других внутриклеточных нарушениях или угрозеих возникновения происходит переключение функций р53 (Рис. 4):приобретая транскрипционные активности и изменяя экспрессию генов-мишеней,он вызывает либо остановку размножения аномальных клеток (временную,для устранения повреждений, или необратимую), либо их гибель (факторы,определяющие судьбу клетки при активации р53 будут рассмотреныниже). В результате устраняется возможность накопления в организмегенетически измененных клеток.

Механизмы активации р53 при стрессах и внутриклеточных повреждениях.Активация транскрипционных функций р53 наблюдается при самых разнообразныхстрессах и внутриклеточных нарушениях: УФ- и g-облучении, присутствиив клетке разорванной ДНК, понижении внутриклеточного пула нуклеотидов,ингибировании ДНК- и РНК-полимераз, гиперэкспрессии онкогенов,вирусной инфекции, гипоксии, оксидативном стрессе, гипо- и гипертермии,различных нарушениях клеточной архитектуры (увеличении числа ядер,изменениях цитоскелета и адгезии) и т.д.

Ключевую роль в стабилизации белка р53 и повышении его транскрипционнойактивности играют изменения взаимодействия р53 с белком-ингибиторомMdm2, ген которого является потенциальным онкогеном. Белок Mdm2связывается с N-концом молекулы р53 и, обладая активностями Е3убиквитин-лигазы, стимулирует убиквитинизацию и, как результат,протеосомную деградацию белка р53. Поэтому, в норме уровень экспрессиир53 очень невелик, а время его жизни составляет всего около 30минут. Кроме того, связываясь с N-концевым участком р53 в районедомена, взаимодействующего с базовыми факторами транскрипции,Mdm2 подавляет способность р53 транс-активировать гены-мишени.

A)

Б)

Рис. 4. Охранные функции р53.
А). Функции "латентной" и "стрессовой" формр53.
Б) Факторы, вызывающие транскрипционную активацию р53, гены-мишениактивированного р53 и вызываемые изменениями их экспрессии биологическиеэффекты.

При внутриклеточных нарушениях, в частности при поврежденияхДНК, происходит фосфорилирование р53 по сайтам (Ser15, Ser20,Ser33), расположенным в районе связывания с белком Mdm2. Такоефосфорилирование осуществляют специфические киназы (ATM, ATR,и их мишени - чекпойнткиназы CHK1, CHK2), которые активируютсяв ответ на разнообразные нарушения структуры ДНК (см. раздел 3.11.1).Кроме того, ATM фосфорилирует и белок Mdm2. В результате блокируетсясвязывание р53 с Mdm2, что вызывает стабилизацию молекул р53 иповышение их транскрипционной активности. При некоторых другихвнутриклеточных изменениях, например при экпрессии в клетке активированныхонкогенов RAS, также наблюдается нарушение взаимодействия р53и Mdm2, но происходит оно из-за повышения экспрессии белка pARF,продукта альтернативной рамки считывания гена INK4a (см. раздел3.4). Белок pARF обладает способностью связываться либо с N-концевымучастком р53, либо с белком Mdm2, препятствуя, таким образом,их непосредственному взаимодействию друг с другом. Интересно,что ген MDM2 сам является транскрипционной мишенью активированногор53. В результате устанавливаются регуляторная петля, стимулирующаядеградацию белка р53 после окончания действия факторов, вызывающихего фосфорилирование или связывание с белком pARF.

Важную роль в приобретении молекулами р53 конформации, способнойтранс-активировать гены-мишени, играют также модификации С-концевогоучастка, а именно ацетилирование его определенных аминокислотныхостатков. При повреждениях ДНК и экспрессии активированного онкогенаRAS эти события инициируются связыванием освобождающегося от Mdm2N-концевого участка p53 с базальным фактором транскрипции р300/CBP,ацетилирующим сначала ингибиторный домен р53 по лизинам 373 и382, а затем (после связывания р53 с респонсивными элементами)и белки хроматина в области генов-мишеней. Таким образом, последовательныепост-трансляционные модификации N-концевого и С-концевого участковр53 вызывают увеличение количества белка р53 в клетке, приобретениеим способности связывать р53-респонсивные элементы и рекрутироватьк генам мишеням базовые факторы транскрипции (компоненты комплексаTFIID РНК-полимеразы II и гистоновые ацетилазы p300/CBP, деконденсирующиехроматин), стимулируя тем самым транскрипцию их мРНК.

При некоторых стрессах, в частности при гипоксии, наблюдаютсяпост-трансляционные изменения р53, вызывающие его переход не кклассической стрессовой конформации, а к ее варианту. Такой р53не транс-активирует гены, содержащие р53-респонсивные элементы,но подавляет транскрипцию других генов-мишеней. Эта, так называемаярепрессионная, форма также фосфорилирована по N-концу, но ее С-концевойучасток не ацетилирован и связывает репрессионные комплексы Sin3/HDAC,вызывающие конденсацию хроматина генов-мишеней.

Гены-мишени р53 и их функции. В настоящее время, помимо Mdm2,обеспечивающего регуляцию самого р53 по принципу обратной связи(см. выше), идентифицировано более сотни генов, являющихся мишенямитранскрипционных активностей р53. Они могут быть разделены нанесколько групп, исходя из их физиологических функций (Рис. 4Б).

Первую группу составляют гены, продукты которых регулируют клеточныйцикл. Важнейшим из них является белок p21Waf1/Cip1 - ингибиторциклинзависимых киназ из семейства Cip/Kip. Повышение его экспрессиивызывает остановку клеточного цикла в поздней фазе G1, что обусловливаетсясвязыванием им комплексов циклин Е/Сdk2, подавлением их способностифосфорилировать белки семейства рRb и освобождать транскрипционныефакторы E2F (см. раздел 3.2.2). Дублирующим механизмом остановкиперехода из G1 в S является подавление активированным р53 транскрипциигена DP1 - транскрипционного фактора, который связывается с E2Fи образует активный комплекс, собственно и активирующий синтезпродуктов, необходимых для входа в фазу S. Заслуживает также вниманияспособность р53 повышать экспрессию гена Siah1, продукт которогостимулирует деградацию b-катенина - транскрипционного фактора,активирующего транскрипцию гена циклина D и онкогена MYC (см.раздел 3.4.2), что вносит дополнительный вклад в индукцию остановкиклеточного цикла в G1. Следует заметить, что р53 может подавлятьактивность Cdk2 не только в результате изменения своих транскрипционныхфункций, но и за счет белок-белковых взаимодействий, а именнонепосредственного связывания циклина Н - компонента киназногокомплекса CAK, осуществляющего активирующее фосфорилирование циклинзависимыхкиназ.

Идентифицирован также ряд генов-мишеней р53, продукты которыхвызывают остановку в фазе G2 (задержка в ней наблюдается в случае,когда р53 активировался уже после того как клетка прошла G1-чекпойнт,или в клетках с инактивированным G1-чекпойнтом). Активированныйр53 подавляет функцию комплекса циклин B/Cdc2, играющего ключевуюроль в переходе из G2 в митоз, по нескольким механизмам. Во-первых,он транс-активирует ген 14-3-3-s, белковый продукт которого связываети секвестрирует комплексы циклин B/Cdc2 в цитоплазме, не даваявозможности им попасть в ядро, где они и должны проявлять своюактивность. Во-вторых, он транс-активирует ген GADD45, белковыйпродукт которого обладает способностью связывать Сdc2, разрушаятаким образом комплексы циклин B/Cdc2. В-третьих, р53 репрессируеттранскрипцию генов циклина B и Cdc2, что уменьшает синтез их продуктов.Следует заметить, что, как и в случае остановки клеточного циклав G1, задержка в G2 при повреждениях ДНК наблюдается и в клеткахс инактивированным р53: она происходит в результате подавленияфункции фосфатаз Cdc25 (Cdc25A при остановке в G1 и Cdc25C приостановке в G2), активирующих соответствующие цикдинзависимыекиназы. Однако в клетках с нарушенной функцией р53 происходитлишь кратковременная задержка в чекпойнтах, а активация р53 обеспечиваетдлительную остановку клеточного цикла, предотвращающую размножениевплоть до исправления дефекта.

Следующая группа р53-регулируемых генов кодирует белки, индуцирующиеапоптоз. При этом р53 контролирует синтез компонентов обоих основныхпутей индукции апоптоза: и митохондриального, и стимулируемого"рецепторами смерти". Так, он регулирует активностьбелков семейства Bcl2, репрессируя ген анти-апоптотического белкаBcl2 и активируя гены про-апоптотических белков Bax, Puma и Noxa.Повышение проницаемости митохондриальной мембраны для цитохромаС и белка AIF достигается и транс-активацией гена p53AIP1 (егопродукт локализуется в митохондриальной мембране и уменьшает мембранныйпотенциал) и гена PIG3 (кодирует оксиредуктазу, которая вовлеченав образование радикалов кислорода, повреждающих мембраны митохондрийи стимулирующих выброс их содержимого). Стимуляция апоптоза, запускаемогорецепторами смерти достигается транс-активацией генов двух изтаких рецепторов - Fas и Killer/DR5 (рецептор для TRAIL). Ещеодной такой мишенью является ген недавно идентифицированного белкаPidd, который содержит домен смерти и при гиперэкспрессии индуцируетапоптоз. Выявлены и другие р53-респонсивные гены (IGF-BP3, PAG608,p85, циклин G), продукты которых стимулирует апоптоз, однако механизмыих апоптогенного действия пока исследованы довольно плохо. Крометого, р53 может индуцировать апоптоз и через другие механизмы,несвязанные с его способностью изменять экспрессию генов-мишеней.Так, мутантные р53, утратившие транскрипционную активность (врезультате делеции С-концевого участка или мутаций в кодонах 22-23),сохраняют тем не менее способность индуцировать апоптоз в некоторых(но не во всех) типах клеток. Предполагается, что этот эффектобусловлен белок-белковыми взаимодействиями р53. Таким образом,при повышении функциональной активности р53 может происходитьактивация сразу многих путей индукции апоптоза, что, по-видимому,обеспечивает надежность его реализации.

Так как р53 контролирует активность генов, продукты которых способнывызвать как остановку клеточного цикла в различных его фазах,так и апоптоз, возникает вопрос, отчего зависит выбор судьбы клеткипри активации р53. Выяснилось, что он определяется множествомфакторов: гистогенетическим типом клеток (например, в нормальныхфибробластах, как правило, наблюдается остановка клеточного цикла,тогда как в лимфоцитах - апоптоз), степенью активации р53 (с увеличениемуровня его экспрессии повышается вероятность апоптоза), функциональнойактивностью сигнального пути pRb-E2F (в фибробластах c инактивированнымpRb или гиперэкспрессированным E2F, наблюдается не остановка вG1, а апоптоз) и т.д. Недавно обнаружено, что еще одним фактором,определяющим выбор между остановкой клеточного цикла и апоптозом,является характер модификации самих молекул р53 и/или их белок-белковыхвзаимодействий. Так р53, фосфорилированный по Ser15/20 и ацетилированныйпо С-концу, способен транс-активировать ген p21Waf1/Cip1 и вызыватьостановку в G1, тогда как дополнительное фосфорилирование по Ser46придает ему способность транс-активировать наряду с геном p21Waf1/Cip1и ген белка р53AIP1, а в этом случае уже наблюдается апоптоз.Причем вероятность фосфорилирования Ser46 повышается с увеличениеминтенсивности повреждений ДНК. Кроме того, способность р53 избирательнотранс-активировать проапоптотические гены (BAX и др.) увеличиваетсяпри его связывании с белками семейства ASPP (ASPP1 и ASPP2), потеряэкспрессии которых характерна для значительной части случаев ракамолочной железы.

Третьей большой группой генов-мишеней р53 являются гены, продуктыкоторых регулируют морфологию и/или миграцию клеток (Рис. 4Б).Так, р53 транс-активирует гены обоих представителей семействарассеивающих (Scatter) факторов - HGF/SF и HGF1/MSP, а также генодного из членов семейства эпидермальных факторов роста HB-EGF(гепарин-связывающий EGF) (продукты всех этих генов являются одновременнои митогенами, и мотогенами). При этом, р53 транс-активирует такжегены рецепторов этих факторов - HGF/SF-R (Met) и EGF-R. р53-респонсивнымитакже являются гены хемокина фракталкина, гладкомышечного a-актина,коллагенов II1 и Vl1 типов, ингибитора плазминогена PAI-1. С другойстороны р53 репрессирует гены фибронектина и металлопротеиназыI типа. Физиологическое значение такой регуляции пока не установлено.Возможно, оно заключается, по крайней мере частично, в привлечениик клеткам с активированным р53 окружающих клеток определенныхтипов для ремоделирования/восстановления структуры ткани в местевозможного апоптоза. Не исключено участие такой регуляции и впроцессах морфогенеза.

В особую группу генов-мишеней р53 можно выделить гены, контролирующиеангиогенез. Ключевую роль в неоангиогенезе играет VEGF (VascularEndothelial Growth Factor- стимулирует размножение и миграциюэндотелицитов), экспрессия которого повыщается при гипоксии илиактивации некоторых онкогенов. р53 репрессирует транскрипцию какгена VEGF, так и гена HIF-1 (Hypoxia Inducing Factor 1) - транскрипционногофактора, обеспечивающего повышение экспрессии VEGF и его рецепторовв ответ на уменьшение содержания кислорода (кроме этого HIF-1изменяет экспрессию генов, контролирующих транспорт глюкозы игликолиз, что обеспечивает адаптацию клеток к условиям гипоксии).Одновременно р53 может транс-активировать гены белков, ингибирующихангиогенез - тромбоспондинов (Tsp)-1, -2 (связывая специфическиерецепторы на поверхности эндотелиоцитов, они вызывают в них апоптоз)и BAI-1. Таким образом клетки с активированным р53 хуже переносятнедостаток кислорода, перестают секретировать VEGF и начинаютсекретировать ингибиторы ангиогенеза, что препятствует образованиюновых сосудов. Данные функции являются, по-видимому, еще однойсоставляющей опухоль-супрессирующего действия р53, так как онипредотвращает адаптацию к гипоксии и прорастание сосудов в центропухоли.

Выявлено еще несколько десятков генов-мишеней р53. Среди нихследует отметить ген каталитической субъединицы теломеразы (TERT),который репрессируется р53 (таким образом, р53 участвует, по-видимому,и в обеспечении репликативного старения клеток. По-видимому, р53принимает участие и в процессах созревания клеток, так как некоторыеиз транс-активируемых им генов кодируют белки репертуара той илииной дифференцировки (мышечная креатинкиназа и др.).

Последствия нарушений функции р53. Характерные для опухолевыхклеток аномалии р53 отменяют или ослабляют все важнейшие функцииопухолевого супрессора р53. Делеция обоих аллелей гена р53, т.е.его полная инактивация, вызывает ослабление G1- и G2-чекпойнтовклеточного цикла, подавление индукции апоптоза, уменьшение эффективностирепарации ДНК, более эффективную адаптацию к гипоксии и стимуляциюнеоангиогенеза, ослабление контроля за длиной теломер, ингибированиедифференцировки и другие характерные свойства неопластическойклетки. Особо следует отметить возникновение в клетках с инактивированнымр53 сильной генетической нестабильности, являющейся мотором дальнейшейопухолевой прогрессии. Потеря функциональной активности р53 значительноувеличивает темп появления размножающихся клеток с самыми разнымигенетическими аномалиями - измененным числом и перестройками хромосом,генными мутациями, амплификацией отдельных участков генома.

Сходные последствия наблюдаются и при самых частых в новообразованияхчеловека аномалиях р53 - миссенс-мутациях, ведущих к синтезу неактивногобелка, обладающего доминантно-негативным эффектом в отношениипродукта неповрежденного аллеля. Следует заметить, однако, чтостепень проявления доминантно негативного эффекта мутантного р53варьирует в зависимости от конкретной аминокислотной замены, типаклеток и ингибируемой функции р53 дикого типа. Поэтому нередкоселективное преимущество получают клоны клеток, в которых в результатедополнительных генетических событий происходит делеция или мутацияи второго аллеля гена р53. В то же время, опухолевые клетки, какправило, сохраняют экспрессию хотя бы одного мутантного аллелягена р53. Очевидно, это связано с тем, что появляющиеся в результатемиссенс-мутаций новые активности мутантных р53 вносят дополнительныйвклад в повышение онкогенного потенциала клетки. Так, приобретаяспособность транс-активировать онкоген MYC, мутантный р53 вызывает,очевидно, более сильные нарушения регуляции клеточного цикла,чем те, которые наблюдаются при делециях гена р53. Новые активностимутантных белков р53 ответственны также за дополнительное ослаблениеиндукции апоптоза и развитие устойчивости к действию химиопрепаратов.В основе подавления апоптоза лежит несколько механизмов: транс-активациямутантным р53 гена антиапоптотического белка Bag1 (член семействаBcl2), способность мутантных р53 связывать и инактивировать гомологр53, белок р73 (см. следующий раздел) и т.д. Возникновение устойчивостик определенным противоопухолевым цитостатикам может быть связанотакже со способностью некоторых мутантных р53 повышать транскрипциюгена MDR1 (Multi-Drug Resistance 1 - см. раздел XII.2.1.1) и генадУТФ-азы, продукт которого блокирует действие 5-фторурацила иряда других антиметаболитов. Следует заметить, что характерныедля опухолей человека мутации дифференциально влияют на возникновениевышеуказанных активностей. Так, замены в кодонах 175 и 248 придаютспособность активировать ген дУТФ-азы, тогда как мутации в кодоне273 не вызывают приобретения такого свойства. Поэтому, использованиемутаций р53 в качестве критерия для предсказания чувствительностик той или иной химиотерапии может быть основано лишь на точнойидентификации аминокислотных замен, а не на гистохимической детекции"нормального" или "мутантного" р53 с помощьюконформационно-специфических антител.

Таким образом, мутации и другие изменения активности р53 вызываютодновременное появление целого набора характерных свойств неопластическойклетки, таких как понижение чувствительности к различным рост-супрессирующимсигналам (в том числе генерируемым перманентной экспрессией активированныхонкогенов), иммортализация, повышение способности выживать в неблагоприятныхусловиях, генетическая нестабильность, стимуляция неоангиогенеза,блокирование клеточной дифференцировки и т.д. Это, очевидно, иявляется объяснением такой частой встречаемости мутаций р53 всамых разных новообразованиях - они позволяют за один шаг преодолетьсразу несколько этапов опухолевой прогрессии. Причем, мутациир53 могут являться как инициальным событием (синдром Ли-Фраумени)или детерминировать начальные этапы канцерогенеза, так и возникатьи отбираться уже в ходе роста опухоли, обеспечивая приобретениеновых агрессивных свойств и устойчивости к терапии.

3.3.4. Гомологи р53: р63 и р73

Недавно были обнаружены два гена, р63 и р73, продукты которыхимеют достаточно высокую степень гомологии с белком р53 в участкахтранс-активационного, ДНК-связывающего и олигомеризационного доменов,но значительно отличающиеся от него по C-концу. Однако, в отличиеот гена р53, кодирующего по существу один белковый продукт, подвергающийся,правда, самым разным пост-трансляционным модификациям, гены р63и р73 продуцируют по несколько белков. Дело в том, что мРНК каждогоиз них может синтезироваться с двух промоторов и далее подвергатьсяальтернативному сплайсингу. В результате образуется по 6 изоформбелков р63 и р73, обладающие (ТА-формы) или не обладающие (?DN-формы)транс-активационным доменом. Причем формы, содержащие транс-активационныйдомен способны активировать р53-респонсивные гены и вызывать,в частности, апоптоз. Кроме того, ТА-формы р63 и р73 могут транс-активироватьи ряд других генов, содержащих близкие по структуре респонсивныеэлементы, которые не являются, тем не менее, мишенями р53. В частности,они транс-активируют гены белков Jag1 и Jag2 - лигандов для рецепторовNotch, активация которых играет ключевую роль в выборе судьбыклетки при выборе направления ее дифференцировки.

Существует еще ряд отличий между р53 и его гомологами. Так, еслир53 экспрессируется в клетках практически всех тканей, то егогомологи экспрессируются только в некоторых типах клеток. Например,р63 преимущественно экспрессируется в эмбриональных клетках, атакже стволовых и недифференцированных эпителиальных клетках взрослогоорганизма, причем в виде транскрипционно-неактивных ?DN-форм.Предполагается, что экспрессия ?DN-форм р63 обеспечивает недифференцированноесостояние клетки. При нокауте гена р63 у мышей наблюдается пренатальнаяили постнатальная гибель эмбрионов вследствие полного отсутствиякожи и других эпителильных тканей (предполагается, что это связанос преждевременной дифференцировкой стволовых клеток эпителия иисчерпанием их запаса к моменту рождения животных). Далее, еслир53 активируется в ответ на самые разные стрессы, то его гомологитолько на некоторые из них, причем за счет совершенно других механизмов.Наконец, если р53 выполняет функции опухолевого супрессора и дляновообразований характерна его инактивация, то его гомологи неимеют таких функций. Об этом свидетельствует две группы фактов.Во-первых, у мышей гомозиготный нокаут гена р73 не вызывает повышениячастоты возникновения опухолей (нокаут гена р63 не совместим сжизнью эмбрионов - см. выше). Во-вторых, в опухолях человека невыявляется потеря экспрессии или мутации генов р63 и р73. Наоборот,в них нередко отмечается повышение экспрессии этих белков, причем,как правило, транскрипционно-неактивных ?DN-форм (т.е. р63 и р73являются скорее протоонкогенами). В связи с этим приобретает популярностьгипотеза, согласно которой ?DN-формы белков р63 и р73 функционируюткак природные ингибиторы р53, подавляющие его функцию по доминантно-негативномумеханизму. Действительно, их транскрипционно-неактивные тетрамерымогут конкурировать с р53 за места посадки на ДНК генов-мишеней,а мономеры/димеры - секвестрировать р53 путем связывания его молекули образования неактивных комплексов. Это не исключает, однако,что при нарушениях функции р53 происходит активация транскрипционнойфункции его гомологов (показано, что р53 репрессирует транскрипциюгена р73), которая может частично компенсировать утрату функциир53 и обеспечивать, например, нормальное развитие мышей с гомозиготнымнокаутом гена р53. Эти предположения, как и другие аспекты биологическихфункций гомологов р53, требуют дальнейшего исследования.