Онкология-

Б.П.Копнин

Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

источник RosOncoWeb.Ru

01 0203 04
4. Онкогены, опухолевые супрессоры и нарушения морфогенетическихреакций клетки

Ярким отличительным свойством неопластических клеток является"асоциальный" тип их поведения, связанный в первую очередьс нарушениями нормальных морфогенетических реакций - потерей контактноготорможения размножения, приобретением способности к пролиферациинезависимо от прикрепления к субстрату, изменениями адгезионныхвзаимодействий, формы и подвижности клеток и т.д. Именно эти нарушениявместе с некоторыми другими свойствами, в частности способностьюсекретировать протеолитические энзимы и ангиогенные факторы, предопределяютинвазивный характер роста (проникновение в окружающие здоровыеткани), а впоследствии и метастазирование (образование вторичныхочагов опухолевого роста) [118]. Первостепенную роль в возникновенииуказанных выше нарушений морфогенетических реакций играют измененияфункции протоонкогенов и/или опухолевых супрессоров (рис.7, 8).

Рис. 7. Изменения активности супрессорных белков и контролируемыхпротоонкогенами сигнальных путей, определяющие зависимость клетокот прикрепления к субстрату и контактное торможение размножения(объяснения в тексте)

Рис. 8. Регулируемые онкогенами сигнальные пути, ответственныеза изменения морфологии и локомоторный фенотип неопластическихклеток (объяснения в тексте)

Присущее нормальным клеткам контактное торможение размножения(прекращение пролиферации при установлении контактов с окружающимиклетками) связывают в первую очередь с повышением экспрессии опухолевыхсупрессоров p16INK4a и p27KIP1 [37,119,120], что обусловливаетнедофосфорилирование pRb и блокирование входа в S-фазу [17] (см.раздел 1). Пути передачи сигнала от плазматической мембраны кингибиторам циклинзависимых киназ пока неясны. Показано только,что повышение в эпителиальных клетках экспрессии Е-кадхерина,вызванное трансдукцией его гена, ведет к накоплению p27KIP1 иостановке клеточного роста [121]. Недавно появились данные о существованиив эпителиальных клетках еще одного пути блокирования клеточногоцикла в ответ на установление межклеточных контактов. Продемонстрировано,что образование эпителиального пласта вызывает накопление р53,тогда как мутации Е-кадхерина и/или разобщение межклеточных контактов,наоборот, вызывают дестабизацию р53 и, как следствие, прекращениеингибирующего воздействия p21WAF1 на комплексы циклин - Cdk. Всвязи с этим можно думать, что онкогенный потенциал мутаций Е-кадхерина,ответственных за развитие наследственных форм рака желудка и многихдругих новообразований [122], по крайней мере частично обусловленизменениями регуляции клеточного цикла, апоптоза и контроля генетическойстабильности [123].

Наряду с инактивацией ряда опухолевых супрессоров (Е-кадхерин,р53, p27KIP1, pRb), вызванной мутациями или связыванием с вируснымионкобелками (pRb - c E1A, E7, T-SV40- p53 - c E1B, E6, T-SV40-p27KIP1 - c E1A и т.д. [7,10,124]), к потере контактного торможенияразмножения может приводить и гиперфункция протоонкогенов, модифицирующихактивность сигнального пути Cdk-pRb-E2F. В частности, она можетбыть вызвана повышением экспрессии Myc или активацией протоонкогенаRas (первый вызывает деградацию p27KIP1 и трансактивацию Cdc25a,второй - деградацию p27KIP1 и повышение экспрессии циклина D1,см. раздел 1).

Независимость от прикрепления к внеклеточному матриксу (anchorageindependence). Чтобы выживать и пролиферировать, нормальные клеткибольшинства типов должны быть прикреплены к внеклеточному матриксу.Два основных фактора лежат в основе этого явления: неспособностьростовых факторов активировать в неприкрепленных клетках комплексыциклин E - Cdk2, ответственные за вход в S-фазу [125], и индукцияапоптоза во многих типах клеток при отсутствии адгезионных взаимодействий(этот тип апоптоза имеет специальное название "аноикис")[126]. И подавление пролиферации, и индукция апоптоза в неприкрепленныхклетках могут быть связаны с активацией р53, вызываемой откреплениемклеток от субстрата и отсутствием сигналов от рецепторов интегринов[58,127]. За подавление входа в S-фазу кроме активации сигнальногопути р53-p21WAF1, по всей видимости, ответственна и аккумуляцияp27KIP1, также закономерно наблюдающаяся при отсутствии контактовклеток с матриксом [127,128]. Однако помимо запуска механизмовнегативного контроля пролиферации (блокирование входа в S-фазуи индукция апоптоза) в ответ на открепление клеток от матриксасуществуют и независимые механизмы позитивной регуляции выживаемостии размножения клеток, инициируемые связыванием интегринов с белкамивнеклеточного матрикса и последующей активацией нерецепторнойтирозинкиназы FAK (Focal Adhesion Kinase - ключевого участникапередачи сигналов от интегриновых рецепторов, физически взаимодействующегос цитоплазматическим доменом b-субъединицы интегрина [118,126]).Во-первых, связывание интегринов с матриксом и активация FAK необходимыдля прохождения митогенного сигнала от рецепторов ростовых факторов(EGF, PDGF) до конечных МАР киназ - ERK1/2. (В неприкрепленнойклетке сигналы от этих ростовых факторов блокируются на промежуточнойМАР киназе MEK1, которая в силу каких-то неизвестных пока причинне фосфорилирует свои мишени - ERK1/2 [64].) Во-вторых, активируяRas через адаптерный белок Shc, интегриновые рецепторы не толькостимулируют митогенный сигнал, но и подавляют аноикис (апоптоз),по всей видимости, за счет активации сигнального пути Ras-PI3K-PKB/Akt[126] (cм. раздел 2).

Если исходить из факта существования нескольких механизмов, определяющихзависимость жизнеспособности и/или размножения клеток от их связыванияс матриксом, становится понятным, что для возникновения характернойдля опухолевых клеток независимости от адгезионных взаимодействийнеобходимо, по-видимому, несколько событий, которые, с одной стороны,позволяли ли бы преодолевать супрессорные эффекты р53 (мутации/делецииэтого гена, гиперэкспрессия онкогена MDM2 и др.) и/или p27KIP1(мутации/делеции- гиперэкспрессия онкогенов RAS и MYC, приводящаяк деградации данного белка, и др.), а с другой, - обходить прерываниемитогенного сигнала на уровне МЕК1 киназы (например, за счет активациибелков Src или Myc, вызывающих активацию комплексов циклин E -Cdk2) и блокировать аноикис по сигнальному пути Ras-PI3K-PKB/Akt.

Изменения формы и подвижности клеток. Изменение формы (морфологии)- характерное свойство опухолевых клеток, позволяющее при микроскопическомисследовании диагносцировать злокачественную трансформацию. Воснове морфологических нарушений лежат связанные между собой измененияцитоскелета, адгезионных взаимодействий клеток друг с другом ис внеклеточным матриксом. Вкратце они выражаются в нарушении формированияфокальных контактов и в ухудшении прикрепления клеток к матриксу,дезорганизации системы актиновых микрофиламентов. Это приводитк изменениям активности псевдоподий и характера перемещения клеток.В целом наблюдаемая картина напоминает изменения, возникающиев нормальных клетках при действии мотогенных цитокинов - факторов,стимулирующих передвижение клеток. Однако так называемый локомоторныйфенотип в неопластических клетках, как правило, сильно утрирован,что позволяет отличать по морфологии опухолевую клетку от движущейсянормальной клетки.

Молекулярные механизмы, определяющие возникновение локомоторногофенотипа, как в нормальных клетках при мотогенных стимулах, таки при неопластической трансформации, пока далеки от ясности. Выявленылишь некоторые ключевые узлы в пересекающихся цепях передачи сигналов,ответственных за возникновение этих изменений. Как известно, многиецитокины (например, HGF/SF, EGF, FGF, PDGF, IGF-1 и др.) являютсяодновременно и митогенами, и мотогенами [118]. Так, HGF/SF (HepatocyteGrowth Factor/Scatter Factor) является сильным митогеном для гепатоцитов,но мотогеном для различных эпителиальных клеток, в частности клетокмолочной железы, эндотелиоцитов и др. Мотогенный эффект HGF/SFзависит от вызываемой им стимуляции Ras-Raf-MAPК сигнальных путей:об этом свидетельствует его отмена при ингибирования функции МЕК1и блокировании передачи сигнала к ERK1/2 [129-131]. В то же времяодного только повышения активности Raf, по-видимому, недостаточнодля разборки в эпителиальных клетках Е-кадхериновых межклеточныхконтактов и стимуляции локомоции клеток - необходима одновременнаяактивация и PI3K, которая при действии HGF/SF может индуцироватьсякак по Ras-зависимому, так и по Ras-независимым сигнальным путям[130,132]. Эффекторы PI3K, ответственные за реализацию мотогенногоэффекта, неизвестны. Показано только, что ни PKB/Akt, ни Rac самипо себе его не обеспечивают [130], хотя базальный уровень активностиRac, по-видимому, необходим для осуществления перестроек цитоскелетаи разъединения межклеточных контактов, требующихся для локомоции[132]. Показано также, что одним из важных эффектов, вызываемыхHGF/SF в клетках лейомиосаркомы, является понижение экспрессиигена фибронектина, что может изменять адгезионные взаимодействияс матриксом и локомоцию [133]. Мутации гена рецептора HGF/SF (протоонкогенаMet), приводящие к перманентной стимуляции его тирозинкиназнойактивности, являются онкогенными: они способны вызывать морфологическуютрансформацию в культивируемых in vitro клетках [134] и ответственныза развитие наследственного папиллярного рака почки, а также некоторыхдругих заболеваний человека (табл. 1). Молекулярные основы мотогенныхэффектов других цитокинов изучены еще хуже, но предполагается,что, как и в случае с HGF/SF, они связаны со стимуляцией Ras-PI3Kи Ras-MAPК сигнальных путей [135-139] .

Конститутивная экспрессия активированных онкогенов Ras вызываети в фибробластах, и в эпителиальных клетках резкое повышение локомоторнойактивности и стойкие морфологические изменения, характерные длянеопластических клеток [140,141] (заметим, однако, что эти измененияхорошо проявляются только в клетках с аномалиями р53- и/или p16INK4a-регулируемыхсигнальных путей- в остальных случаях в ответ на перманентнуюгиперэкспрессию Ras может индуцироваться либо апоптоз, либо остановкав G1, уменьшающая степень выраженности Ras-индуцированных морфологическихизменений [117,142]. Предполагается, что несколько эффекторовRas, в первую очередь Raf и GTPазы семейства Rho (Rac, Cdc42,Rho), ответственны за проявление морфологической трансформациии за стимуляцию локомоторной активности неопластических клеток[20,143] (рис. 8). Как и при мотогенных эффектах цитокинов, ключевуюроль здесь, по-видимому, играет активация двух сигнальных каскадов:Ras-PI3K-Rac и Ras-Raf-ERK [20,143-145]. Для трансформации фибробластов,очевидно, достаточно конститутивной активации любого из этих путей.Действительно, трансдукция активированного Rac1, как и активированныхRaf, Mos (подобно Raf стимулирует MEK1), или самой МЕК1 можетвызывать морфологическую трансформацию фибробластов грызунов [146-150],а блокирование в Ras-трансформированных клетках функции либо MEK1,либо Rac, хотя и приводит к частичной реверсии морфологическихизменений, но не предотвращает трансформацию [148,151]. В то жевремя в эпителиальных клетках, хорошо трансформирующихся онкогеномRas, активации Raf-ERK-каскадов недостаточно, чтобы вызвать морфологическуютрансформацию [149]. Экспрессия активированного Rac придает эпителиальнысмклеткам некоторые признаки трансформированного фенотипа (в первуюочередь образование ламеллоподий и раффлинг мембран [143,152]),однако сильная морфологическая трансформация достигается, по-видимому,только при совместной активации Rac-зависимых и Raf-ERK сигнальныхпутей [144,153].

О молекулярных событиях, ответственных за морфологическую трансформациюпри активации Rac и Raf-ERK сигнальных путей, известно очень мало.Стимуляция MAP киназ ERK1/2 ведет, как известно, к активации рядатранскрипционных факторов, в частности Elk1, Fos, SRF. Заметим,что одним из важнейших последствий гиперфункции Rac является стимуляциядругого МАР киназного каскада (рис. 8), конечный продукт которого- JNK - вызывает активацию транскрипционных факторов Jun и ATF2.Таким образом, и Raf-ERK-, и Rac-JNK-сигнальные пути регулируютактивность транскрипционных комплексов AP-1 (состоит из гомодимеровJun/Jun или гетеродимеров Jun/Fos), функция которых представляетсявесьма важной для индукции морфологических изменений. Об этомсвидетельствуют как способность самого онкогена Jun вызывать трансформациюклеток [154,155], так и реверсия трансформированного фенотипапри подавлении функции Jun [156,157]. Не исключено, впрочем, чтотрансформирующий потенциал Jun (AP-1) связан не с прямым действиемна мишени, регулирующие адгезивные взаимодействия, организациюцитоскелета и локомоцию, а с образованием аутокринной петли, обусловленнойстимуляцией продукции ростовых факторов/мотогенов (EGF и др.),которые в свою очередь активируют Ras и его эффекторы, в частностиRac и другие GTPазы семейства Rho (Cdc42, RhoA), ответственныеза изменения морфологии [155,157] (рис. 8). Так предполагается,что Rac обеспечивает образование ламеллоподий и раффлинга, Cdc42- вызывает образование филоподий, а RhoA участвует в формированиифокальных контактов и стресс-фибрилл [143,152].

Существующие модели рассматривают образование ламеллоподий какследствие Rac-индуцированного повышения активности белка Por1[126,152], возникновение стресс-фибрилл - как последствие активациимиозинфосфатазы под действием Rho-киназы, а образование фокальныхконтактов - как результат связывания с актином цитоскелетных белковпрофилина и гельзолина, стимулируемого фосфатидилинозитолбифосфатом- одной из мишеней Rho [126,152]. Пока неясно, однако, обеспечиваютсяли все эти реакции передачей сигналов исключительно между цитоплазматическимибелками или изменение активности множества транскрипционных факторовтакже вносит свой вклад в эти процессы.

Таким образом, главенствующую роль в морфологической трансформациии приобретении локомоторного фенотипа играют, очевидно, протоонкогены,изменения активности которых приводят к активации белков семействаRas и/или его эффекторов - PI3K, Raf и, возможно, RalGDS. По-видимому,только совокупность вызываемых ими изменений в регуляции активностипсевдоподий, сборки/разборки цитоскелета и фокальных контактовпри одновременном изменении активности большого набора транскрипционныхфакторов обеспечивает в конце концов приобретение клетками такназываемого "полностью трансформированного" фенотипа,определяющего агрессивный характер роста. Следует, однако, учитывать,что для проявления этих изменений необходима инактивация опухолевыхсупрессоров (p53 p19ARF и/или p16INK4a), предохраняющих организмот появления в нем клонов клеток с конститутивно активированнымиRas-MAP-киназными сигнальными путями. Кроме того, выраженностьморфологической трансформации и способности к локомоции уменьшаютсяпри повышении экспрессии некоторых других опухолевых супрессоров- Е-кадхерина [118] и pRb [158]. Более того, два других важнейшихпризнака неопластической клетки - ослабление контактного торможенияразмножения и приобретение независимости от субстрата - зависятв первую очередь от инактивации определенных опухолевых супрессоров(р53, p27KIP, Rb, Е-кадхерина). Поэтому кажется очевидным, чтодля возникновения характерных для опухолевых клеток измененийморфогенетических реакций требуется несколько генетических событий(мутаций), затрагивающих и опухолевые супрессоры, и протоонкогены.

5. Онкогены и опухолевые супрессоры в неоангиогенезе

Неоангиогенез - формирование сети капилляров из эндотелиальныхклеток, выстилающих мелкие венулы - необходимое условие для дальнейшегороста опухолевого узелка, достигшего в диаметре 2-4 мм [118,159].Приобретение неопластическими клетками способности стимулироватьпролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток связано, очевидно,с двумя основными событиями: прекращением секреции ими факторов,ингибирующих ангиогенез (тромбоспондины и др.), и увеличениемпродукции цитокинов, являющихся факторами роста и мотогенами дляэндотелиоцитов (в первую очередь VEGF, а также FGF, EGF, TGF-a),сопровождающимся повышением секреции и/или активности протеаз,обеспечивающих протеолиз внеклеточного матрикса и инвазию эндотелиоцитовв ткани новообразования.

Ключевую роль в возникновении ангиогенного фенотипа неопластическихклеток играет, по-видимому, инактивация функции опухолевого супрессорар53, контролирующего экспрессию некоторых ингибиторов и стимуляторовангиогенеза. Так, гены тромбоспондинов 1 и 2 является мишеньютрансактивационного действия р53 [160,161], а транскпицию генаVEGF р53, наоборот, подавляет [162,163]. Вместе со способностьюр53 активироваться в ответ на гипоксию [164], это предопределяетеще один механизм, посредством которого нормальное функционированиер53 может защищать организм от опухолевого роста: гипоксия, возникающаяв центре неопластического узелка, индуцирует р53 и, как следствиеапоптоз или остановку клеточного цикла, сопровождающуюся повышениемсекреции тромбоспондинов и снижением экспрессии VEGF, что должнопредотвращать неоваскуляризацию узелка. Естественно поэтому, чтоинактивация р53 может являться важным этапом в приобретении способностистимулировать ангиогенез. Действительно, при анализе механизмоввозникновения ангиогенного фенотипа в человеческих фибробластахбыло обнаружено, что в большинстве случаев именно инактивацияр53 является инициальным событием [165].

К дальнейшему усилению способности стимулировать ангиогенез можетприводить экспрессия онкогенов, в частности онкогенов семействаRAS, вызывающих активацию транскрипционного комплекса AP-1 и,как следствие, с одной стороны, повышение секреции VEGF, ген которогосодержит респонсивные элементы для АР-1 [165-169], а с другой,- увеличение продукции ряда матриксных металлопротеиназ (MMP-9/колллагеназаIV, MMP-1 и др.) [169-171], гены которых также регулируются AP-1[172,173] и другими Ras-индуцируемыми транскрипционными факторами,в частности Ets1 [172,173].

Следует заметить, что последовательность событий, приводящихк развитию ангиогенного фенотипа, может быть и иной: в фибросаркомаху трансгенных мышей появление ангиогенного фенотипа инициировалосьне мутациями р53, а повышением экспрессии JunB и с-Jun компонентовкомплекса АР-1 и последующим повышением секреции из опухолевыхклеток FGFb [174]. Получены данные о роли и других онкогенов иопухолевых супрессоров в регуляции ангиогенеза. Так, Myc подавляеттранскрипцию тромбоспондина 1 [26], тогда как опухолевый супрессорVHL, мутации которого вызывают синдром фон Хиппеля-Линдау (развитиемножественных гемангиом) и карциномы почки [175] (табл.2), осуществляетнегативную регуляцию экспрессии гена VEGF в стромальных клеткахгемангиом [176] и клетках почечного эпителия [177]. Таким образом,очевидно, что изменения активности определенных опухолевых супрессорови онкогенов играют решающую роль в стимуляции ангиогенеза.

6. Роль онкогенов и опухолевых супрессоров в приобретении способностик метастазированию

Метастазирование - образование вторичных очагов опухолевого роста- наиболее опасное проявление прогрессии новообразований, являющеесяосновной причиной смерти онкологических больных. Чтобы дать метастаз,клетка должна приобрести ряд свойств: умение проникать в глубинуокружающих нормальных тканей (в том числе в кровеносные или лимфатическиесосуды), способность выживать после попадания в сосуды, а затемпенетрировать их и размножаться в несвойственном для данного типаклеток микроокружении, давая новый очаг опухолевого роста [118].Таким образом, способность к метастазированию складывается изкомплекса более простых признаков, значительная часть которых- приобретение локомоторного фенотипа и повышенной протеолитическойактивности, способность стимулировать ангиогенез и создавать темсамым пути эвакуации опухолевых клеток из первичного очага, возникновениенезависимости от субстрата и подавление апоптоза, - уже была рассмотренав предыдущих разделах. Появление каждого из этих признаков увеличиваетвероятность развития метастатического потенциала. Однако наиболееважными представляются гены и белки, такие, например, как р53,Ras и Src, изменения активности которых приводят к возникновениюсразу нескольких компонентов метастатического фенотипа, а, крометого, - к генетической нестабильности, облегчающей появление дополнительныхпризнаков, необходимых для метастазирования. Интересно, что р53,нарушения функции которого существенно увеличивают способностьклеток давать метастазы в модельных системах in vivo [58,178,179],помимо всего прочего прямо активирует транскрипцию недавно открытогогена KAI1 [180] - трансмембранного белка, образующего комплексыс Е-кадхерином. Потеря экспрессии белка KAI1, обусловленная втом числе и инактивацией р53 [180], закономерно обнаруживаетсяв различных опухолях человека на поздних стадиях заболевания (60-90%случаев рака предстательной, поджелудочной и молочной желез, мелкоклеточногорака легкого, гепатоцеллюлярного рака и др.) [181-185], а восстановлениеего экспрессии вызывает ингибирование метастатического процесса[186-188]. Кальцийсвязывающий белок S100A4/MTS1/CAPL (метастазин),наоборот, гиперэкспрессируется на поздних стадиях развития различныхновообразований человека [189] и обладает способностью придаватьклеткам инвазирующий и метастатический потенциал [190-192]. Егоэкспрессия также вызывает плейотропный эффект: она приводит куменьшению содержания Е-кадхерина [193], подавлению синтеза ингибитораметаллопротеиназ TIMP-1 [194], изменениям регуляции динамики реорганизацийцитоскелета в результате ингибирования фосфорилирования тяжелойцепи миозина [195] и, возможно, к секвестрированию и функциональнойинактивации р53 [189].

Разумеется, описанные выше изменения не исчерпывают переченьконтролируемых опухолевыми супрессорами и/или протоонкогенамипризнаков, которые могут играть существенную роль в приобретенииспособности к метастазированию. Так, значительный интерес представляетописанный Г.И.Дейчман так называемый "H2O2CA+PGES"-фенотип,заключающийся в повышении антиоксидантных активностей, секрециипростагландина E2 и, как следствие, в приобретении еще большейустойчивости к факторам естественной противоопухолевой резистентностии приобретенного иммунитета [196,197]. Этот фенотип индуцируетсяв культивируемых in vitro клетках путем трансдукции определенныхизоформ онкогена v-src, но не другими исследованными генами (активированныйH-ras, myc, bcl2, мутантный р53, E1A, LT SV40) или возникает впроцессе роста опухоли in vivo, причем метастатическая способностьклеток коррелирует с его. Очевидно, в ближайшие годы нас ждути другие важные находки, проливающие свет на механизмы метастазированияи роль в этих процессах опухолевых супрессоров и онкогенов.