Онкология-

Б.П.Копнин

Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

источник RosOncoWeb.Ru

01 0203 0405 0607
3.2. pRb - первый идентифицированный опухолевый супрессор

3.2.1. Открытие гена Rb

Идентификация опухолевых супрессоров началась с обнаружения генаRb, врожденные мутации которого вызывают развитие ретинобластом.В начале 1970-х г.г. Кнудсон, проводя эпидемиологические исследования,отметил, что около 40% ретинобластом возникает в младенческомвозрасте (средний возраст 14 месяцев). Причем эти опухоли какправило билатеральные (возникают из сетчатки обоих глаз) и частомножественные (в среднем по 3 независимых опухоли на пациента).Если такие пациенты в результате хирургического вмешательстваизлечивались от ретинобластом, у многих из них в юношеском возрастеразвивались остеосаркомы, а в зрелом возрасте - меланомы кожи.При этом во многих случаях отмечался наследственный характер заболевания.Кнудсон сформулировал гипотезу, согласно которой, если дети наследуютмутантный аллель гена, позже названного Rb, то вторая мутация,происходящая уже в ретинобласте, ведет к возникновению опухоли.Это довольно частое событие (происходит примерно у 95% пациентовс частотой около трех на пациента) и, поэтому, предрасположениек развитию болезни имеет доминантный характер наследования. Кнудсонпредположил также, что дети, у которых ретинобластомы возникаютв более позднем возрасте (частота таких опухолей невелика - 1на 30000 индивидуумов), не наследуют мутантный аллель гена Rb.Вместо этого у них происходят две независимые мутации в одномиз ретинобластов, что и приводит к развитию опухоли. Следовательно,согласно гипотезе Кнудсона, у первой группы пациентов имеетсяодна врожденная и одна приобретенная мутации, тогда как у второйгруппы больных обе мутации приобретенные.

Так как при некоторых наследственных ретинобластомах обнаруживалисьнебольшие делеции участка длинного плеча хромосомы 13 (13q14),было предположено, что ген "предрасположенности к ретинобластоме"(Rb) локализуется именно в этом участке генома. И действительно,с помощью позиционного клонирования был изолирован ген, оба аллелякоторого инактивированы в клетках как наследственных, так и спорадическихретинобластом. При этом при наследственных формах заболеваниявсе клетки организма имели врожденные мутации этого гена. Такимобразом, стало ясно, что постулируемые Кнудсоном две мутации,необходимые для развития ретинобластом, происходят в разных аллеляходного и того же гена Rb. Инактивация гена Rb была обнаруженане только в ретинобластомах, но и в клетках некоторых других,ненаследственных новообразований: практически во всех случаяхмелкоклеточного рака легкого, части случаев (20-40%) острого лейкоза,остеосаркомы, рака мочевого пузыря, простаты и др. Восстановлениеэкспрессии этого гена в культивируемых in vitro клетках ретинобластоми остеосарком приводило к торможению их роста. Таким образом,впервые были получены веские доказательства существования генов,полная инактивация которых приводит к развитию новообразованийи продукты которых способны подавить размножение неопластическихклеток. Закономерности, выявленные при исследовании гена Rb, вчастности ассоциация с наследственными формами опухолей и необходимостьпоражения обоих аллелей (рецессивный характер проявления мутаций),стали использоваться в качестве критериев при поиске и идентификациидругих опухолевых супрессоров.

В настоящее время достигнут значительный прогресс в пониманиинормальной функции продукта гена Rb (pRb) в клетке, охарактеризованытипы и местоположение мутаций в гене Rb при ретинобластомах идругих новообразованиях, предложены высокоэффективные методы скринингамутаций Rb у индивидуумов в группах риска.

3.2.2. Функция pRb в клетке и ее нарушения при канцерогенезе

pRb представляет собой фосфобелок c мол. массой 105кД, локализующийсяв ядре и экспрессирующийся в большинстве типов клеток. Он дефосфорилированв неделящихся клетках, а также в пролиферирующих клетках, находящихсяв начале G1 фазы клеточного цикла. В таком состоянии pRb образуеткомплексы с рядом белков, в том числе с белками, вызывающими ремоделированиехроматина (гистоновые деацетилазы HDAC, комплексы SWI-SNF) и транскрипционнымифакторами семейства E2F, регулирующими активность генов, продуктыкоторых необходимы для начала и прохождения S-фазы (циклин Е,циклин А, дигидрофолатредуктаза, тимидинкиназа, PCNA, ДНК-полимеразаa и др). Транскрипция этих генов подавлена, если E2F связан скомплексами HDAC/pRb/SWI-SNF. При митогенных сигналах pRb в серединеG1 фазы фосфорилируется по определенным аминокислотным остаткамциклинзависимой киназой циклин D/Сdk4(6), что вызывает отвязываниеот него HDAC. Комплекс pRb/SWI-SN (без HDAC) не блокирует способностьE2F транс-активировать ген циклина E, но репрессирует транскрипциюдругих E2F-регулируемых генов, в частности циклина А. В результатев конце G1 фазы происходит избирательная активация циклинзависимойкиназы циклин Е/Cdk2, которая дополнительно фосфорилирует pRbпо другим аминокислотным остаткам. Это вызывает высвобождениетранскрипционного фактора E2F из комплексов с pRb/SWI-SNF и егоактивацию, приводящую к повышению экспрессии циклина А и другихгенов, продукты которых необходимы для синтеза ДНК (Рис. 1).

Рис. 1. pRb регулирует активность транскрипционных факторов семействаE2F и циклинзависимых киназ, ответственных за вход и продвижениепо S фазе клеточного цикла (объяснения в тексте).

После завершенияS фазы pRb переходит в дефосфорилированное состояние, в которомон блокирует активность E2F и вход в следующую S фазу (для ее инициациинеобходим новый митогенный стимул, активирующий комплексы циклинD/Cdk4). Таким образом, модулируя активность E2F и регулируемыхим генов, pRb играет ключевую роль в контроле последовательностисобытий, обеспечивающих переход клетки из G0/G1 в S фазу и ее успешноезавершение. В дополнение к E2F pRb связывает и модулирует активностьряда других транскрипционных факторов, большинство из которых тканеспецифичныи участвуют в регуляции определенных дифференцировочных программ.Так, он увеличивает транскрипционную активность некоторых представителейсемейства bHLH (MyoD и др.), которые стимулируют мышечную дифференцировкуи семейства C/EBP, играющих ключевую роль в моноцитарно-макрофагальной(NF-IL6) и адипоцитарной (C/EBP-b) дифференцировках. Кроме того,pRb связывает и репрессирует гомеобокс-содержащие транскрипционныефакторы (Pax-3, Mhox, Chx10), определяющие судьбу клетки в раннемэмбрионенезе. Все это дало основание полагать, что основная физиологическаяфункция pRb заключается в детерминировании некоторых терминальныхдифференцировок, для чего необходима остановка клеточного цикла(осуществляется за счет подавления функции E2F) и индукция экспрессииряда специализированных белков (реализуется путем модификации активноститканеспецифичных транскрипционных факторов). Значительная частьмутаций гена Rb, обнаруживаемых в различных опухолях, вызывают либоделецию гена, либо сдвиг кодирующей рамки, либо ее преждевременнуютерминацию, либо нарушения сплайсинга мРНК. Все это приводит илик полной потере экспрессии белкового продукта, или к экспрессиинеполноценных и нестабильных белков pRb. В части случаев наблюдаютсямиссенс-мутации, вызывающие замену одного из аминокислотных остатков.Такие мутации поражают домен, ответственный за связывание pRb cрядом клеточных белков и вирусными онкобелками - T-SV40, E1A аденовирусови E7 HPV. По-видимому нарушение функции именно этого домена, вызываемоелибо мутациями, либо его связыванием с вирусными онкобелками, являетсякритичным для подавления супрессорной активности pRb. При мутацияхобоих аллелей гена Rb, вызывающих отсутствие в клетке белка pRbили экспрессию его функционально неактивной формы, транскрипционныйфактор E2F находится в перманентно активированном состоянии. Это,во-первых, уменьшает зависимость размножения клеток от ростовыхфакторов, а во-вторых, отменяет негативную регуляцию клеточной пролиферациипри рост-ингибирующих сигналах. Кроме того, потеря функции pRb нарушаетпроцессы клеточной дифференцировки. Все это резко увеличивают вероятностьпоявления постоянно пролиферирующих клонов клеток, в которых будутнакапливаться и другие онкогенные мутации, ведущие к злокачественнойтрансформации. При этом, пока остается неясным, почему при врожденнойинактивации одного из аллелей гена Rb во всех клетках организмау пациента в юном возрасте развивается именно ретинобластома, ане какие-то другие новообразования. Интересно, что у трансгенныхмышей с инактивацией одного из аллелей гена Rb (инактивация обоихаллелей несовместима с жизнью эмбрионов из-за нарушений эритропоэзаи нейрогенеза) возникают не ретинобластомы, а медуллярные раки щитовиднойжелезы или аденомы средней доли гипофиза, возникающие из меланофоров(в отличие от мышей у человека эта ткань в гипофизе атрофирована).Более того, ретинобластомы не развиваются и у химерных мышей, вовсех клетках сетчатки которых инактивированы оба аллеля гена Rb.Отсутствие ретинобластом у таких химерных мышей может быть объясненоотносительно небольшим, по сравнению с человеком, количеством клетокв сетчатке, что уменьшает вероятность возникновения в течение короткойжизни животного в одном из ретинобластов дополнительных генетическихизменений, необходимых для развития новообразования. Меньшая вероятностьтаких событий может быть также связана с отсутствием у лабораторныхмышей дополнительных канцерогенных факторов, таких как облучениеклеток сетчатки солнечным светом, способствующему, очевидно, развитиюретинобластом в аналогичной ситуации у человека. В пользу предположенияо необходимости для развития ретинобластом дополнитльных событийможет свидетельствовать тот факт, что ретинобластомы возникают утрансгенных мышей, экспрессирующих вирусный онкобелок T-SV40, которыйсвязывает и инактивирует не только pRb, но и его гомологи (см. ниже),а также другой опухолевый супрессор - р53 (см. раздел 3.3).

3.2.3.Гомологи pRb: p107 и Rb2/p130

Несколько позже, в начале 90-х гг.было идентифициоровано два гена, продукты которых, белки р107 иRb2/p130, имеют структурное сходство и частично перекрывающиесяфункции с pRb. Так, подобно pRb, они способны подавлять активностьE2F-респонсивных генов и блокировать вход в фазу S. Вместе с тем,они имеют ряд отличий от pRb. В частности, они связывают толькоE2F4 и E2F5, тогда как рRb взаимодействует с E2F1, E2F2, E2F3 иE2F4. Возможно поэтому р107 и Rb2/p130, в отличии от pRb, не способныподдерживать длительное пребывание в G0 и дифференцировку некоторыхтипов клеток, например миоцитов. Нарушения функции гомологов pRb,по-видимому, не причастны к инициальным этапам развития каких-либоопухолей человека, так как пока не выявлены наследственные формыновообразований с врожденными герминальными мутациями генов р107или Rb2/p130. Кроме того, у мышей с гетерозиготным нокаутом этихгенов частота возникновения опухолей не повышается. В то же времясоматические инактивирующие мутации гена Rb2/p130 характерны длячасти случаев лимфомы Беркита, рака носоглотки и мелкоклеточногорака легкого, причем, как правило, они выявляются на поздних стадияхзаболевания. Вероятно, нарушения функции этого гомолога pRb обеспечиваютпрогрессию некоторых новообразований.