Гематология-воздействие новых активностей мутантных р53 на клеточный цикл, апоптоз и чувствительность к цитостатикам

Опухолевый супрессор р53 является центральным компонентом внутриклеточнойохранной системы, предотвращающей размножение и накопление в организмеаномальных клеток. К р53 ведут многочисленные сигнальные пути, распознающиеразличные внутриклеточные изменения, такие как повреждения ДНК,недостаток пула нуклеотидов, гипоксия, тепловой и холодовой шок,вирусная инфекция, экспрессия активированных онкогенов, разрушенияцитоскелета и т.д. Действие этих факторов приводит к стабилизациир53, изменению его конформации и переходу в функционально активноесостояние. Являясь транскрипционным фактором, активированный р53изменяет экспрессию ряда генов-мишеней, продукты которых регулируютпродвижение по клеточному циклу (p21WAF1, Gadd45, 14-3-3s, jqклинВ и др.) и апоптоз (Bax, Bcl2, PIG3, Fas, Killer/DR5 и др.). В результатеактивация р53, вызываемая различными внутриклеточными изменениями,приводит либо к остановке клеточного цикла в G1 и G2 фазах, либок гибели клетки. Таким образом, р53 выполняет важнейшую охраннуюфункцию, осуществляя выбраковку аномальных и потенциально опасныхклеток. Нарушения функции р53 резко увеличивают вероятность развитияновообразований. Так, врожденные мутации р53 вызывают синдром Ли-Фраумени,характеризующийся развитием в молодом возрасте множественных первичныхопухолей.

Нарушения функции р53 являются наиболее универсальным молекулярнымизменением в различных новообразованиях человека. Они могут возникатьлибо еще в нормальной клетке и увеличивать таким образом вероятностьобразования из нее неопластического клона, либо происходить ужев опухолевых клетках и детерминировать дальнейшую прогрессию новообразования.Следует подчеркнуть, что, изменяя регуляцию чекпойнтов клеточногоцикла и апоптоза, нарушения функции р53 модифицируют чувствительностьклеток к противоопухолевым препаратам.

Как правило, в опухолях выявляются миссенс-мутации р53, приводящиек замене одной из аминокислот на другую, причем с наибольшей частотоймутации встречаются в трех "горячих точках": кодонах175, 248 и 273. Вероятно, экспрессия мутантного р53 придает клеткедополнительные селективные преимущества по сравнению с клетками,в которых изменения в гене р53 приводят просто к потере экспрессииповрежденного аллеля. Этот факт может объясняться, по крайнеймере, двумя причинами. Во-первых, мутантный белок обладает доминантно-негативнымэффектом в отношении белка дикого типа, то есть точечная мутациядаже в одном из двух аллелей способна полностью подавить охраннуюфункцию р53. Во-вторых, в последнее время появляются данные, указывающиена существование у мутантных форм р53 вновь приобретенных активностей("gain-of-function"). Известно, например, что за счеттаких активностей мутантный р53 может специфически и с высокойаффинностью связываться с МАR/SАR ДНК-элементами, вызывая ремоделированиехроматина, транс-активировать промоторы ряда генов (онкогена myс,рецептора эпидермального фактора роста и др.), а также увеличиватьметастатический потенциал опухолевых клеток. Однако молекулярныеосновы вновь приобретенных активностей и их роль в процессах канцерогенезапока практически не изучены.

Мы предприняли попытку исследовать влияние вновь приобретенныхактивностей мутантного р53 на регуляцию клеточного цикла, апоптозаи чувствительности к цитостатикам. Для этого были изучены эффектымутантных р53 с аминокислотными заменами в кодонах 175, 248 или273, являющихся "горячими точками" мутаций в различныхопухолях человека. Новые активности мутантных р53 выявляли путемих трансдукции в культивируемые in vitro клетки, не продуцирующиеэндогенный р53. Использование клеток, в которых отсутствует экспрессияэндогенного р53, позволяло исключить проявления доминантно-негативногоэффекта и исследовать действие только вновь приобретенных активностейтрансдуцированного мутантного р53.

Нами были получены и проанализированы производные клеток мышии человека с конститутивной или тетрациклин-репрессируемой экспрессиейэкзогенного р53. В последнем случае экспрессия мутантного р53подавлялась добавлением в культуральную среду тетрациклина (1мкг/мл). Через 24-48 ч после перевода полученных нами сублинийклеток в среду без тетрациклина наблюдается индукция экспрессииэкзогенного мутантного р53, не сопровождающаяся повышением экспрессиигенов-мишеней р53 дикого типа (p21WAF1 и др.).

Воздействие новых активностей мутантных р53 на клеточный цикли скорость пролиферации клеток

Вновь приобретенные активности мутантного р53 вызывают существенноеувеличение скорости пролиферации клеток. Так, введение вектора,конститутивно экспрессирующего мутантный р53-His175, повышаетскорость размножения р53-негативных мышиных фибробластов линии10 (3) примерно в 1,5 раза: в логарифмической фазе роста времяудвоения клеточной популяции уменьшалось с 23,5 ч до 16 ч. Сходнаякартина наблюдалась и в случае тетрациклин-регулируемой экспрессиир53-His175 в клетках человеческой карциномы легкого линии Н1299или мышиных фибробластах линии 10 (1), что подтверждало связьвыявленных различий в скорости пролиферации именно с экспрессиеймутантного р53, а не с какими-то вторичными изменениями, возникающимив результате длительной селекции клеток с экзогенным мутантнымр53. Следует подчеркнуть, что индукция экспрессии р53 дикого типав этих клеточных контекстах приводила не к уменьшению, а к увеличениювремени удвоения клеточной популяции или к апоптозу.

Ускорение размножения клеток под влиянием вновь приобретенныхактивностей мутантного р53 обусловлено, по-видимому, их воздействиемна регуляцию клеточного цикла. Анализируя кинетику появления меченыхмитозов после добавления 5-бромдезоксиуридина на 20 мин., мы определялипродолжительность отдельных фаз клеточного цикла в логарифмическойфазе роста. Оказалось что, включение экспрессии мутантного р53значительно уменьшает время прохождения клеточного цикла за счетсущественного укорочения продолжительности S-фазы. При этом мутантныйр53 не оказывал существенного влияния на продолжительность другихфаз клеточного цикла.

Вновь приобретенные активности мутантного р53, помимо измененийрегуляции клеточного цикла при нормальных физиологических условиях,могут модифицировать функцию G1-чекпойнта, активируемого повреждающимивоздействиями. Мы обнаружили, что индукция экспрессии мутантногор53-His175 в клетках 10 (1) и Н1299 приводит к тому, что в S-фазувходит в 1,5-2 раза больше клеток с повреждениями ДНК, индуцированнымиалкилирующим соединением этилметансульфонатом (ЭМС), тогда какэкспрессия р53 дикого типа, наоборот, уменьшает долю поврежденныхклеток, входящих в S-фазу. В то же время р53-His175 практическине влияет на активность чекпойнта, оперирующего в G2.

Механизмы выявленных нами эффектов вновь приобретенных активностеймутантного р53 в отношении регуляции клеточного цикла пока неясны.Наиболее вероятным является предположение о том, что эти изменениясвязаны со способностью р53-His175 увеличивать экспрессию генаmyc. Его продукт, как было показано ранее, может, с одной стороны,транс-активировать ген орнитин-декарбоксилазы и вызывать, такимобразом, укорочение S-фазы, а с другой стороны активировать комплексыциклин E/Cdk2 и отменять остановку поврежденных клеток при переходеиз G1 в S.

Воздействие новых активностей мутантных р53 на индукцию апоптоза

Мутантные р53 могут модифицировать действие цитостатиков, изменяяне только регуляцию G1-чекпойнта, но и ослабляя индукцию апоптоза.При этом, новые активности мутантного р53 воздействуют как наапоптоз, вызываемый повреждениями ДНК, так и на апоптоз, индуцируемый"доменами смерти" ("death receptors") последобавления в культуральную среду TNF-a или антител к Fas. Следуетподчеркнуть, что такие эффекты мутантных р53 в значительной степенизависят от конкретной аминокислотной замены, типа апоптоза и,возможно, клеточного контекста. Так, p53-His175, значительно сильнее,чем p53-Trp248 или p53-His273, подавляет апоптоз, вызываемый ДНК-повреждающимивоздействиями (ЭМС, этопозид). В то же время p53-His273 сильнее,чем p53-His175, подавляет Fas-индуцируемый апоптоз в человеческихклетках рака простаты линии PС-3. Кроме того, различные мутантныер53 дифференциально воздействуют на апоптоз, индуцируемый Fasи TNF-a.

Механизмы действия вновь приобретенных активностей мутантныхр53 на регуляцию апоптоза исследованы пока довольно плохо. Недавнообнаружено, что одним из путей такой регуляции может являтьсятранс-активация гена BAG1, кодирующего антиапоптотический белоксемейства Bcl2.

Воздействие новых активностей мутантных р53 на чувствительностьк химиопрепаратам

Помимо неспецифического воздействия на чувствительность к цитостатикампосредством изменения регуляции клеточного цикла и апоптоза, новыеактивности мутантных р53 могут оказывать и более специфическоедействие на чувствительность к определенным лекарственным средствампутем изменения регуляции мишеней химиопрепарата. Используя методсубтрактивной гибридизации мы идентифицировали неизвестные ранеемишени трансактивационного действия мутантных р53 и обнаружили,что в группу генов, специфически активируемых мутантными р53,входит ген, кодирующий дезокси-УТФ-азу. Функция дУТФазы заключаетсяв гидролизе дУТФ до дУМФ и пирофосфата. В свою очередь, дУМФ служитсубстратом для образования дТТФ de novo. Предполагается, что повышениеуровня дУТФазы может вызывать устойчивость к 5-фторурацилу, широкоприменяемому химиопрепарату, механизм действия которого связанс ингибированием синтеза дТТФ путем подавления активности тимидилатсинтетазы.Мы обнаружили, что индукция экспрессии р53-His175 или p53-His248,также как и введение конструкта, экспрессирующего УТФ-азу, вовсех исследованных нами культурах (карцинома легкого H1299, ракяичника SKOV-3, фибробласты 10 (1) в 1,5-2 раза увеличивала числоклеток, способных образовывать колонии после воздействия 5-фторурацила.При этом устойчивость к двум другим препаратам - метотрексатуи адриамицину - не увеличивалась. В то же время р53-His273, необладающий способностью транс-активировать ген УТФ-азы, не увеличивалустойчивость данных клеточных культур к 5-фторурацилу.

Очевидно, существуют и другие пути, посредством которых вновьприобретенные активности мутантных р53 оказывают влияние на чувствительностьклеток к тем или иным цитостатикам. Так, мы обнаружили, что влейкозных клетках линии К562, в отличие от клеток 10 (1) и др.,экспрессия p53-His175 вызывает существенное уменьшение чувствительностик метотрексату. Экспрессия этого мутанта несколько увеличивалатакже устойчивость лейкозных клеток к действию винбластина, нопрактически не меняла чувствительности к этопозиду. В то же время,экспрессия p53-His273 не понижала, а, наоборот, несколько повышалачувствительность клеток К562 к метотрексату и винбластину. Механизмыэтих эффектов остаются неясными.

Таким образом, мы обнаружили, что вновь приобретенные активностимутантных р53 с аминокислотными заменами в разных положениях различнымобразом влияют на чувствительность к разным химиопрепаратам. Приэтом могут отличаться не только эффекты разных мутантных р53 водном и том же типе клеток, но и действие одного и того же мутантав клетках разного происхождения. Все это необходимо учитыватьпри предпринимающихся в настоящее время попытках использоватьмутации р53 для предсказания результатов противоопухолевой химиотерапии.