Апоптоз при патологии шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека

Видео: ВПЧ ассоциированные заболевания

Введение

Видео: Профилактика ВПЧ ассоциированных заболеваний шейки матки. Ведение пациенток после лечения CINРШМ

Апоптоз, или программированнаяклеточная гибель, является универсальным физиологическим процессом,который в комплексе с клеточной дифференцировкой и пролиферациейподдерживает гомеостаз на тканевом и соматическом уровнях. Морфологическиапоптоз характеризуется конденсацией хроматина, впячиванием клеточноймембраны, расширением эндоплазматического ретикулума, сморщиваниемцитоплазматических гранул и самих клеток, фрагментацией ядра собразованием апоптотических телец, попадающих во внеклеточноепространство. Вслед за этим происходит достаточно быстраяэлиминация апоптотической клеткиили ее фрагментов фагоцитирующими клетками.
Апоптоз является процессом, контролируемым и тонко регулируемыммногочисленными факторами. К их числу относятся сигнальные молекулы,запускающие апоптоз (FAS, TNF, некоторые цитокины), рецепторыэтих молекул (FasR, TNFR1, TCR-CD3), внутриклеточные мессенджерыполученного сигнала (FADD, TRADD, RIP), онкосупрессоры (р53, р21,pRB), протеинкиназы, протеинтирозинкиназы, фосфатазы, сериновыепротеазы (семейства ICE и Mch), стимуляторы апоптоза (Bax, Bcl-xs,Bad, Bak), ингибиторы апоптоза (Bcl-2, Bcl-xl и другие), эндонуклеазы[1].
Важным этапом программированной гибели клеток являетсяхарактерное расщепление ДНК на олигонуклеосомные фрагменты [2,3]. Одним из наиболее исследованных ферментов, участвующих в межнуклеосомнойфрагментации ДНК, является семейство Ca²⁺/Mg²⁺-зависимых эндонуклеаз (СМЭ) [4-6], изменения активностикоторых выявлены при различных физиологических и патологическихпроцессах в организме [7], в связи с чем степень деградации ДНКдо олигонуклеосомных фрагментов, осуществляемая СМЭ, считаетсяодним из биологических маркеров интенсивности апоптоза.
В норме апоптоз наряду с участием в органогенезе, формообразованиии поддержании постоянства клеточного состава служит для удаленияклеток, претерпевших неопластическую трансформацию либо имеющихгенетические или иные нарушения, способные привести к развитиюрака. Однако известны патологические состояния, при которых механизмпрограммированной клеточной гибели оказывается заблокированным,что приводит к бурной пролиферации раковых клеток, не сдерживаемойконкурирующим процессом апоптоза [8, 9]. В частности, это относитсяк развитию предраковых процессов и рака шейки матки, в которых,как доказано в последние годы, ведущую роль играет папилломавируснаяинфекция [10, 11]. Выявление наличия вируса папилломы в половыхпутях в последние годы стало возможным благодаря внедрению современныхтехнологий молекулярной биологии, таких как ДНК-гибридизация,полимеразная цепная реакция (ПЦР) и др. Активно внедряется в практикувысокочувствительный метод Hybrid Capture, который был разработанфирмой "Digene". Он заключается в ДНК-гибридизации в растворес последующей сорбцией на полистероловой планшете [12]. Благодарятаким методам практический врач получил возможность определятьналичие высокоонкогенных типов вируса папилломы человека (ВПЧ)в половых путях женщины, что помогает осуществить правильную тактикулечения и наблюдения каждой конкретной пациентки с патологиейшейки матки и избежать нередко ненужных травмирующих манипуляций.

Апоптоз в диагностике предраковыхи раковых заболеваний шейки матки

По данным многочисленныхпубликаций, одним из ключевых моментов трансформации клеточногороста является взаимодействие белков высокоонкогенных типов ВПЧ(в первую очередь, Е6) с онкосупрессором р53, что приводит к ингибированиюпоследнего. Так, L. Rapp и J. Chen наблюдали деградацию р53, наступающуюв результате связывания с ним белка Е6 [13]. Полагают, что E6подавляет активность защитного белка p53, стимулируя его деградациюпутем протеолиза, в который вовлечен ассоциированный с Е6 белокЕ6АР [14]. Любопытно, что данная функция Е6АР была характернатолько для образцов цервикальной карциномы, но не для нормальногоэпителия.
Аналогичные данныепредставлены в работе M. Thomas и соавт. [15], исследовавших особенностивзаимодействия белка Е6 с молекулами-мишенями, выявляемыми в образцахцервикальной карциномы. Показано, что в отличие от многих другихопухолей в клетках цервикальной карциномы экспрессируется “дикий”(без мутаций) тип р53, а инактивирующая роль белка Е6 сопоставимас мутацией р53. В то же время известно, что в клетках человекасуществуют молекулы, способные связываться с Е6, снижая такимобразом его антиапоптотический потенциал и защищая клетки эпителияот пролиферации. Так, один из наиболее вероятных кандидатов нароль блокатора Е6 был идентифицирован D. Pim и L. Banks. Быловыявлено, что белок E6-I (ингибитор белка Е6), взаимодействуяс нативным Е6 ВПЧ 18 типа, препятствовал деградации р53, опосредованной Е6, и блокировал пролиферациюлинии цервикальных раковых клеток. В то же время ингибированиебелком E6-I трансформированного клеточного роста коррелировалос его способностью индуцировать апоптоз по р53-зависимому пути[16].
Второй основнойонкопротеин вируса папилломы человека - Е7, являющийся нарядус Е6 фактором развития цервикального рака, оказывает свой эффектпосредством связывания с онкосупрессором белка ретинобластомы(Rb) и его инактивации. S.Seavey и соавт. показали, что такаяспециализация Е7 наблюдается при наличии Е6, инактивирующего р53[17]. Однако в искусственно созданной клеточной системе, в которойЕ6 не было, Е7 связывался с р53, стабилизируя его, что сохранялоего функцию как индуктора транскрипции и активировало продолжительноеклеточное деление и утрату клетками чувствительности к индукцииапоптоза ультрафиолетовым излучением. Напротив, данные M. Iglesiasи соавт. о повышении продукции интерлейкина-1 нормальными цервикальнымикератиноцитами при апоптозе и корреляции между уровнями экспрессии генов ИЛ-1 и Е7 ВПЧ16-го и 18-го типов свидетельствуют о том, что белок Е7 повышаетчувствительность кератиноцитов к апоптозу [18]. Похожий эффектнаблюдали G. Kilic и соавт. при исследовании путей регуляции апоптозав культурах клеток рака цервикального канала (линия клеток С33а),мутантных по генам р53 и ретинобластомы, инфицированных и не инфицированныхонкопротеинами Е6 и Е7 [19]. Было показано, что различные индукторыапоптоза (митомицин, стауроспорин, гамма-излучение) вызывают апоптозво всех исследуемых случаях. При этом наличие в клетках С33а онкопротеинаЕ7 коррелирует с повышением уровня апоптоза в ответ на воздействиеиндукторов. Эти данные свидетельствуют о наличии независимогоот р53 и ретинобластомы пути регуляции апоптоза. В пользу этоговывода высказывается также N.Prabhu и соавт., обнаружившие, чтоаналог р53 онкосупрессор p73-бета не подвергается деградации вкультуре клеток цервикальной карциномы с высоким уровнем продукцииЕ6 и не утрачивает своей протективной функции в отличие от р53[20].
Наряду с исследованием механизмов онкогенного воздействияна клетки эпителия шейки матки белков ВПЧ активно изучается рольсобственных клеточных факторов организма-хозяина, ингибирующихапоптоз, и их сложного взаимодействия с индукторами апоптоза.Понимание этих механизмов могло бы создать систему защиты эпителияшейки матки от развития злокачественной пролиферации.
Так, в экспериментахin vitro показано, что экспрессияпротоонкогена bcl-2 может блокировать апоптоз, опосредованныйp53, в образцах клеточной аденокарциномы влагалища и цервикальногоканала. C целью проверки этого наблюдения в системе in situ былопроведено исследование S.Waggoner и соавт. [21]. Во всех образцах,в которых предварительно было показано наличиегена р53, иммуногистохимически был выявлен белок bcl-2, причемв 18 из 21 случая его количество варьировало от умеренного довысокого. Несмотря на присутствие дикого типа р53, только в 4образцах была отмечена фрагментация ДНК, свидетельствующая обапоптозе. По мнению авторов, несмотря на то, что в результатеповреждения ДНК при трансформации нормальных цервикальных клетокв раковые наблюдается суперэкспрессия гена р53, его онкопротективныйэффект в большинстве случаев блокируется одновременной экспрессиейbcl-2. Таким образом, очевидно, что при карциноме влагалища ишейки матки существует механизм, способный препятствовать развитиюапоптоза без мутационных повреждений гена р53. Ранее X. Liangи соавт. показали, что ни в одной из клеточных линий цервикальнойкарциномы с активной экспрессией bcl-2 (в отличие от нормальныхкератиноцитов) не определяется функционально активный белок р53,либо представленный мутантным типом, либо инактивированный путемсвязывания с белком Е6 ВПЧ [22]. Одновременное повышение уровняэкспрессии bcl-2 и снижение уровня продукции или активности р53на фоне папилломавирусной инфекции могут служить важной предпосылкойразвития предраковых процессов и рака цервикального канала. Вто же время повышение экспрессии bcl-2, возможно, играетроль не во всех типах рака шейки матки. Так, в работе K. Kokawaи соавт. иммуногистохимическим методом в образцах инвазивной плоскоклеточнойкарциномы (ИПКК) и инвазивной эндоцервикальной карциномы (ИЭК)белок bcl-2 не был выявлен [23]. Незначительная продукция генаBax, являющегося индуктором апоптоза, была зарегистрирована вотдельных клинических образцах при ИПКК, в то время как во всехслучаях инвазивной эндоцервикальной карциномы уровень экспрессииэтого гена был высоким, часто сочетаясь с активным апоптозом.Корреляционный анализ полученных данных позволил авторам сделатьвывод о том, что апоптоз развивается в раковых клетках инвазивнойаденокарциномы цервикального канала в случае высокого уровня экспрессиигена Bax, что подтверждается результатами других исследователей[12].
Представленные результаты свидетельствуют о разнообразиипутей опосредованного апоптозом блокирования пролиферации трансформированныхклеток эпителия шейки матки. В то же время частота случаев цервикальногорака довольно высока, и переход нормального роста клеток в неопластическийи раковый нередко непредсказуем. В этой связи большое значениеприобретают статистические исследования, к которым относится работаC. Isacson и соавт., посвященная оценке корреляционной зависимостимежду активностью пролиферативных процессов, интенсивностью апоптозаи онкогенностью ВПЧ в образцах цервикальной неоплазии [24]. Былопоказано, что активность пролиферации клеток возрастает по мереповышения степени CIN- одновременно с этим увеличиваетсяи количество клеток, подвергшихся апоптозу. Апоптотическиеклетки выявлялись в единичных случаях в образцах CIN I степении отсутствовали в нормальном эпителии. Cтатистически значимойзависимости уровня пролиферации и апоптоза от степени онкогенностиВПЧ показано не было. О повышении апоптотического индекса по мерепрогрессии CIN от низкой до высокой степени свидетельствуют такжеданные Y. Shoji и соавт., которые, кроме того, не выявили корреляциимежду уровнем апоптоза и наличием папилломавирусной инфекции [25].Позднее в работе K. Kokawa и соавт. была исследована зависимостьмежду уровнем апоптоза и гистологическим типом клеток при инвазивнойцервикальной карциноме [23]. Ткани были получены от 19 пациентокс ИПКК, 9 пациенток с инвазивной эндоцервикальной карциномой(ИЭК) и 15 пациенток с миомой матки. Было показано, что в образцахнормального цервикального эпителия и ИПКК ДНК в основном не разрушается.Интенсивная специфическая деградация ДНК была выявлена толькопри ИЭК. Тем не менее в образцах как ИПКК, таки ИЭК уровень деградации был значительно выше, чем в нормальномцервикальном эпителии. В экспериментах in situ авторами было показано,что клетки, подвергшиеся апоптозу, преобладали среди неопластическихклеток при ИЭК. Однако в образцах ИПКК "апоптотических" клетокне было найдено, за исключением единичных экземпляров, локализованныхв центрах активной пролиферации раковых клеток. Вероятно, этиданные могут свидетельствовать о различиях в исходе того или иногоклинического случая в зависимости от морфологической принадлежностиопухоли и уровня апоптоза. Возможно, оценка роли этих факторовпомогла бы предсказать пути прогрессии заболевания, посколькуизвестно, что в 60-62% случаях CIN III степени регрессирует безлечения и только не более чем в 10% случаев прогрессирует в карциному.

Использование апоптоза в терапиипредраковых и раковых заболеваний шейки матки

В настоящее времяпрактически не вызывает сомнения, что терапевтический эффект напредраковые процессы и рак шейки матки можно было бы оказать,предотвращая пролиферацию трансформированных клеток и индуцируяили активируя процесс апоптоза. В работе Y.Tsao и соавт. былаоценена возможность использования в генной терапии цервикальногорака белкового фактора р21, способного блокировать клеточный ростпутем ингибирования циклин-зависимой киназы [26]. В клеточныелинии рака шейки матки, инфицированные и не инфицированные ВПЧ,вводили рекомбинантный аденовирус, в который была клонированануклеотидная последовательность кДНК р21- при этом было показаноподавление клеточного роста путем программированной гибели раковыхклеток, оцененной по уровню фрагментации ДНК.
В работе V. Giandomenico и соавт. была проведена оценкаантипролиферативного эффекта, оказываемого на две клеточные линииплоскоклеточной цервикальной карциномы - ME180 и SiHa тремя способами:1) рекомбинантным интерфероном (ИФН) b- 2) ИФНb в сочетании с ретиноевой кислотой (РК)- ИФНa [27]. Результаты исследованияпоказали, что ИФНbоказывает более выраженное воздействие на обе клеточные линии,чем ИФНa2b. При этом применение РК оказывало синергичный с обоимитипами ИНФ эффект при воздействии на ME180. Было показано, чтоантипролиферативный эффект коррелирует с индукцией апоптоза. Авторыполагают, что действие ИФН на раковые клетки опосредовано ИФН-регулирующимфактором-1 и ингибитором циклин-зависимой киназы фактором р21,которые вовлечены в подавление клеточного роста и в индукцию апоптоза.
Наряду с описаннымиподходами к терапии рака шейки матки и профилактики его развитияна фоне СIN и других заболеваний, вызванных папилломавируснойинфекцией, с использованием р21, ИФНa, ИФНb и РК предлагаются другие методы (часто отработанные толькона клеточных моделях), основанные на применении в качестве лекарственногосредства препаратов, влияющих на процессы апоптоза: оксида мышьякаAs₂O₃[28], N-(4-гидроксифенил)-ретинамида [29], атрактилoзида [30],5-фторурацила [31], TGF-b1 [32], ингибиторов циклинзависимых киназ AG 1478 и AG 555 [33]и других факторов. При этом, несмотря на различия как природыуказанных препаратов, так и механизмов их действия, все они оказываюттерапевтический эффект, индуцируя апоптоз в трансформированныхВПЧ кератиноцитах, неопластических и раковых клетках.
По-видимому, уровеньапоптоза, достаточный для поддержания баланса между пролиферациейи элиминацией клеток в нормальной ткани, значительно снижаетсяпри раковой трансформации, что и приводит к развитию опухоли.Очевидно, что эффективность терапевтического воздействия зависитот своевременного определения нарушений механизмов программированнойклеточной гибели, которые предшествуют формированию цервикальнойкарциномы. Наряду с морфологическим исследованием оценить этинарушения можно либо путем определения многочисленных регуляторныхфакторов апоптоза (при этом результат анализа нередко не поддаетсяинтерпретации), либо путем определения активности осуществляющихдеградацию клетки эффекторных молекул, которая прямо коррелируетс интенсивностью апоптоза. К числу последних относятся эндонуклеазы,ферментативная активность которых повышается при усилении апоптоза,что приводит к межнуклеосомной деградации ДНК. Одним из наиболееинформативных современных методов оценки деградации ДНК являетсяпредложенный впервые в 1992 г. Y. Gavrieli и соавт. метод TUNEL(от англ. "terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated biotin-dUTP nick-end labeling"), суть которогозаключается в визуализации путем световой микроскопии специфическойокраски ядер в клетках с фрагментированным хроматином [34].
Резюмируя представленную в настоящей публикации информацию,следует отметить, что, несмотря на сложность регуляции процессовпролиферации и гибели клеток, а также на существующую на сегодняшнийдень неопределенность исхода ассоциированных с ВПЧ патологическихпроцессов в шейке матки, уже предложены надежные методы их определенияи возможной терапии, основанные на оценке и индукции процессаапоптоза, разработка и использование которых в ближайшем будущемпозволят значительно снизить количество неблагоприятных исходовCIN и рака шейки матки.

Литература:
1. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме.// Патол.физиол.эксп. терап. 1998- 2: 38-48.
2. Wyllie A.H. Glucocorticoid-induced thymocyteapoptosis is associated with endogenous endonuclease activation.// Nature 1980- 284: 555-6.
3. Wyllie A.H., Morris R.G., Smith A.L., DunlopD. Chromatin cleavage in apoptosis: association with condensedchromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis.// J Pathol 1984- 142: 67-77.
4. Khodarev N.N. and Ashwell J.D. An induciblelymphocyte nuclear Ca/Mg-dependent endonuclease associated withapoptosis.// J Immunol 1996- 156: 922-31.
5. Krueger E., Sokolova I., Kamradt M., KhodarevN.N., Vaughan A.T. Multiple forms of endonuclease activity linkedwith radiation induced apoptosis in C4-1 cervical carcinoma cells.// Anticancer Res 1998- 18(2A): 983-8.
6. Woo K.R., Shu W.P., Kong L., Liu B.C. Tumornecrosis factor mediates apoptosis via Ca++/Mg++ dependent endonucleasewith protein kinase C as a possible mechanism for cytokine resistancein human tenal carcinoma cells.// J Urol 1996- 155(5): 1779-83.
7. Basnak`ian A.G., Topol` L.Z., Kirsanova I.D.,Votrin I.I., Kiselev F.L. Activity of topoisomerase I and endonucleasesin cells transfected by a ras oncogene. // Mol.Biol.(Mosk) 1989-23(3): 750-7.
8. Cuende E., Ales-Martinez J.E., Ding L., Gonzales-GarciaM., Martinez A.C., Nunez G. Programmed cell death by bcl-2 dependentand independent mechanisms in B lymphoma cells.// EMBO J 1993-12: 1555-60.
9. Hale A.J., Smith C.A., Sutherland L.C., StonemanV.E.A., Longthorne V.L., Culhane A.C., Williams G.T. Apoptosis:molecular regulation of cell death. // Eur J Biochem 1996- 236(1): -26.
10. Pillai M.R., Halabi S., McKalip A., JayaprakashP.G., Rajalekshmi T.N., Nair M.K., Herman B. The presence of humanpapillomavirus-16/-18 E6, p53, and bcl-2 protein in cervicovaginalsmears from patients with invasive cervical cancer. // CancerEpidemiol Biomarkers Prev 1996- 5(5): 329-35.
11. Sheets E.E., Yeh J. The role of apoptosisin gynaecological malignancies. // Ann Med 1997- 29(2): 121-6.
12. Nair P., Nair K.M., Jayaprakash P.G., PillaiM.R. Decreased programmed cell death in the uterine cervix associatedwith high risk human papillomavirus infection. // Pathol OncolRes 1999- 5(2): 95-103.
13. Rapp L., Chen J.J. The papillomavirus E6proteins. // Biochim Biophys Acta 1998- 1378(1): 1-19.
14. Beer-Romero P., Glass S., Rolfe M. Antisensetargeting of E6AP elevates p53 in HPV-infected cells but not innormal cells. // Oncogene 1997- 14(5): 595-602.
15. Thomas M., Pim D., Banks L. The role ofthe E6-p53 interaction in the molecular pathogenesis of HPV. //Oncogene 1999- 18(53): 7690-700.
16. Pim D., Banks L. HPV-18 E6*I protein modulatesthe E6-directed degradation of p53 by binding to full-length HPV-18E6. // Oncogene 1999- 18(52): 7403-8.
17. Seavey S.E., Holubar M., Saucedo L.J., PerryM.E. The E7 oncoprotein of human papillomavirus type 16 stabilizesp53 through a mechanism independent of p19 (ARF). // J Virol 1999-73(9): 7590-8.
18. Human papillomavirus type 16 E7 proteinsensitizes cervical keratinocytes to apoptosis and release ofinterleukin-1alpha. / Iglesias M., Yen K., Gaiotti D., HildesheimA., Stoler M.H., Woodworth C.D. // Oncogene 1998- 17(10): 1195-205.
19. Kilic G., Cardillo M., Ozdemirli M., ArunB. Human papillomavirus 18 oncoproteins E6 and E7 enhance irradiation-and chemotherapeutic agent-induced apoptosis in p53 and Rb mutatedcervical cancer cell lines. // Eur J Gynaecol Oncol 1999- 20(3):167-71.
20. Prabhu N.S., Somasundaram K., SatyamoorthyK., Herlyn M., El-Deiry W.S. p73beta, unlike p53, suppresses growthand induces apoptosis of human papillomavirus E6-expressing cancercells. // Int J Oncol 1998- 13(1): 5-9.
21. Waggoner S.E., Baunoch D.A., Anderson S.A.,Leigh F., Zagaja V.G. Bcl-2 protein expression associated withresistance to apoptosis in clear cell adenocarcinomas of the vaginaand cervix expressing wild-type p53. // Ann Surg Oncol 1998- 5(6):544-7.
22. Liang X.H., Mungal S., Ayscue A., MeissnerJ.D., Wodnicki P., Hockenbery D., Lockett S., Herman B. Bcl-2protooncogene expression in cervical carcinoma cell lines containinginactive p53. // J Cell Biochem 1995- 57(3): 509-21.
23. Kokawa K., Shikone T., Otani T., NakanoR. Apoptosis and the expression of Bax and bcl-2 in squamous cellcarcinoma and adenocarcinoma of the uterine cervix. //Cancer 1999-85(8): 1799-809.
24. Isacson C., Kessis T.D., Hedrick L., ChoK.R. Both cell proliferation and apoptosis increase with lesiongrade in cervical neoplasia but do not correlate with human papillomavirustype. // Cancer Res 1996- 56(4): 669-74.
25. Shoji Y., Saegusa M., Takano Y., Ohbu M.,Okayasu I. Correlation of apoptosis with tumour cell differentiation,progression, and HPV infection in cervical carcinoma. // J ClinPathol 1996- 49(2): 134-8.
26. Tsao Y.P., Huang S.J., Chang J.L., HsiehJ.T., Pong R.C., Chen S.L. Adenovirus-mediated p21((WAF1/SDII/CIP1))gene transfer induces apoptosis of human cervical cancer celllines. // J Virol 1999- 73(6): 4983-90.
27. Giandomenico V., Vaccari G., Fiorucci G.,Percario Z., Vannuchi S., Matarrese P., Malorni W., Romeo G.,Affabris G.R. Apoptosis and growth inhibition of squamous carcinomacells treated with interferon-alpha, IFN-beta and retinoic acidare associated with induction of the cyclin-dependent kinase inhibitorp21. // Eur Cytokine Netw 1998- 9(4): 619-31.
28. Zheng J., Deng Y.P., Lin C., Fu M., XiaoP.G., Wu M. Arsenic trioxide induces apoptosis of HPV16 DNA-immortalizedhuman cervical epithelial cells and selectively inhibits viralgene expression. // Int J Cancer 1999- 82(2): 286-92.
29. Oridate N., Suzuki S., Higuchi M., MitchellM.F., Hong W.K., Lotan R. Involvement of reactive oxygen speciesin N-(4-hydroxyphenyl)-retinamide-induced apoptosis in cervicalcarcinoma cells. // J Natl Cancer Inst 1997- 89(16): 1191-8.
30. Brown J., Higo H., McKalip A., Herman B.Human papillomavirus (HPV) 16 E6 sensitizes cells to atractyloside-inducedapoptosis: role of p53, ICE-like proteases and the mitochondrialpermeability transition. // J Cell Biochem 1997- 66(2): 245-55.
31. Ueda M., Kumagai K., Ueki K., Inoki C.,Orino I., Ueki M. Growth inhibition and apoptotic cell death inuterine cervical carcinoma cells induced by 5-fluorouracil. //Int J Cancer 1997- 71(4): 668-74.
32. Rorke E.A., Jacobberger J.W. Transforminggrowth factor-beta 1 (TGF beta 1) enhances apoptosis in humanpapillomavirus type 16-immortalized human ectocervical epithelialcells. // Exp Cell Res 1995- 216(1): 65-72.
33. Ben-Bassat H., Rosenbaum-Mitrani S., HartzstarkZ., Shlomai Z., Kleinberger-Doron N., Gazit A., Plowman G., LevitzkiR., Tsvieli R., Levitzki A. Inhibitors of epidermal growth factorreceptor kinase and of cyclin-dependent kinase 2 activation inducegrowth arrest, differentiation, and apoptosis of human papillomavirus 16-immortalized human keratinocytes. // Cancer Res 1997-57(17): 3741-50.
34. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A.Identification of programmed cell death in situ via specific labelingof nuclear DNA fragmentation. // J Cell Biol 1992- 119(3): 493-501.