Возрастные изменения генетического аппарата клеток

В возрастных изменениях метаболизма организмов высших животных решающее значение имеют изменения функциональной полноценности процессов анаболизма.

Сужение анаболических возможностей и нарастание с возрастом изменений и искажений в программе синтеза нуклеиновых кислот и белков принимаются как важнейшие моменты многими современными теориями молекулярных основ онтогенеза.

В основе этих изменений постулируются происходящие с возрастом как запрограммированные, так и стохастические изменения макромолекулярного состава и тончайшей структуры синтезирующего нуклеиновые кислоты и белки аппарата клетки — то, что образно может быть названо «печатью возраста» на геноме клетки.

Многие закономерности возрастных изменений генетического аппарата клеток еще не выяснены. Однако имеется довольно много экспериментальных работ, которые свидетельствуют о том, что при старении изменяется структура почти всех изученных компонентов генетического аппарата клеток.

«Печать возраста» на молекулярной структуре дезоксирибонуклеиновой кислоты

Первоначальное предположение о нарушении (пессимизации) при старении макромолекулярной структуры ДНК и ее комплексов исходило из присущей значительной части старых клеток пикнотизации хроматина и существенного падения в старости процессов синтеза нуклеиновых кислот и белков в организмах (Никитин, 1941, 1954).

Позднее было установлено, что суммарный состав преобладающей группы азотистых оснований в ДНК и РНК тканей печени и слизистой оболочки кишечника белых крыс и уток практически не меняется с возрастом (Никитин, Шерешевская, 1961- Сквирская, Бабий, 1961- Махинько, Блок, 1961- Бердышев и др., 1967- Хилобок, 1967).

Эти данные не исключают, однако, того, что в последовательности азотистых оснований в отдельных, функционально весьма важных, локусах ДНК могут происходить, и в дальнейшем они действительно были найдены, возрастные изменения.

Еще сложнее оценить данные по суммарной РНК: в нее входят такие ее различные виды, как мРНК, рРНК, тРНК и др. Полученные Бердышевым и сотр. (1967) данные о составе ДНК в различных тканях горбуши на разных этапах нереста послужили первым экспериментальным доказательством того, что «печать возраста» лежит собственно на ДНК.

По мере старения горбуши в ДНК всех тканей (мышцы, печень, почки, селезенка) происходит резкое уменьшение содержания метилцитозина. Обнаруженные у горбуши возрастные изменения по содержанию метилцитозина в ДНК, по-видимому, представляют собой частный случай довольно общего биологического феномена.

Аналогичные изменения в ДНК происходят и при старении различных видов млекопитающих и рыб (Никитин, Куртасов, 1972- Ванюшин и др., 1973- Ванюшин, Бердышев, 1977- Зиньковская и др., 1978). Так, у крыс установлена тканевая специфичность ДНК по содержанию 5-метилцитозина (Ванюшин и др., 1973). Особенно ярко эти тканевые различия выражены у молодых животных (1-месячных).

У взрослых (12-месячных) они вновь четко выявляются. Старение у крыс сопровождается заметными изменениями содержания метилцитозина в ДНК. В отличие от нерестующей горбуши, у которой резко уменьшается количество 5-метилцитозина в ДНК всех тканей, у стареющих крыс содержание 5-метилцитозина в ДНК мозга, селезенки и сердца уменьшается, а в ДНК печени и легких вовсе не изменяется.

Данные о составе ДНК, выделенной из одной и той же ткани крыс с помощью методов Мармура с проназной обработкой и по Шмидту и Таннгаузеру, одинаковы. Поэтому найденные тканевые различия и возрастные изменения могут быть отнесены к суммарной ДНК соответствующих органов и не могут объясняться неполной или необычной экстракцией ДНК из тканей крыс разного возраста.

Поскольку функциональное назначение остатков 5-метилцитозина в разных нуклеотидных последовательностях ДНК, по-видимому, различно, особое значение приобретает вопрос о том, в каких именно участках генома или фракциях ДНК происходит это возрастное изменение содержания 5-метилцитозина.

Несмотря на то что еще нет конкретных экспериментальных данных о характере этих изменений в геноме крыс, есть все основания думать, что они вовсе не хаотичны. Поскольку в ДНК печени и других органов крыс при старении не происходит изменений содержания ГЦ-пар оснований, количества пиримидиновых последовательностей и кинетики реассоциации, найденные возрастные тканеспецифические изменения количества 5-метилцитозина в ДНК на самом деле отражают разный уровень метилирования ДНК у животных различного возраста.

Это подтверждается данными изучения акцептирующей способности ДНК из разных органов молодых и старых крыс при метилировании этих ДНК в присутствии 3Н-метил-S-аденозилметионина (Ванюшин, Бердышев, 1977). С возрастом изменяется акцептирующая способность ядерных ДНК при метилировании in vitro (табл. 16).

Тканеспецифическое изменение акцепторной способности ДНК

Так, фермент из ядер клеток молодых животных метилирует ДНК ядер мозга старых крыс значительно больше, чем ту же ДНК молодых животных. Изменение уровня акцепторной способности при метилировании in vitro, по-видимому, может служить более чувствительным показателем степени метилирования ДНК в исходных клетках (ядрах) по сравнению с прямым определением содержания 5-метилцитозина в ДНК.

Например, прямо выявить видимые различия количества 5-метилцитозина в ДНК из Легких Стареющих животных не удается. Тем не менее отмечено, что уровень метилирования этой ДНК in vivo несколько снижается при увеличении возраста, поскольку акцептирующая способность in vitro у ДНК старых животных несколько выше, чем у ДНК молодых.

Таким образом, при старении происходит тканеспецифическое изменение акцепторной способности ДНК при реакции метилирования in vitro. С возрастом она заметно увеличивается у ядерной ДНК мозга, немного возрастает у ДНК легких и почти не изменяется у ДНК печени.

Следовательно, снижение уровня 5-метилцитозина в ДНК некоторых тканей (головной мозг, сердце) при увеличении возраста происходит за счет уменьшения уровня метилирования ДНК. Этот процесс может происходить в результате падения ДНК-метилазной активности и снижения синтеза донора метальных групп S-аденозилметионина или за счет деметилирования ДНК. Вероятнее всего, в стареющих клетках может быть и то, и другое.

С этими данными совпадают результаты исследований Никитина и Куртасова на крысах (1972) и Зиньковской и сотр. (1978) на печени крупного рогатого скота разного возраста. В работе Зиньковской и сотр. (1978) исследовались эмбрионы, неполовозрелые телята (возраст до 1 года) и старые коровы (возраст 10—12 лет) одной и той же породы.

В процессе онтогенеза у крупного рогатого скота содержание 5-метилцитозина в ДНК разных органов заметно уменьшается. Однако в отличие от горбуши, где уменьшение уровня метилирования ДНК отмечено во всех изученных тканях без исключения, и подобно крысам у коров наблюдается выраженное тканевоспецифическое уменьшение содержания 5-метилцитозина в ДНК. Так, максимально (почти в 2 раза) уровень метилирования ДНК с возрастом падает в сердечной мышце, а в ДНК легких от эмбрионального состояния до старости содержание 5-метилцитозина практически не меняется.

Еще во время эмбрионального развития прослеживается любопытная динамика уменьшения содержания 5-метилцитозина в ДНК сердца. У плодов (около 6 мес) количество 5-метилцитозина в ДНК сердечной мышцы максимально (1.76 ± 0.01 мол.%), у девятимесячных плодов оно снижается до 1.36 ± 0.01 мол.% и не отличается от содержания 5-метилцитозина в ДНК неполовозрелых телят возраста до 1 года.

Наиболее резкое уменьшение количества 5-метилцитозина в ДНК сердца происходит при старении (0.94 мол.%). Значительное уменьшение уровня метилирования ДНК с возрастом происходит также в головном мозге, почках и селезенке. Так, заметное уменьшение уровня метилирования ДНК генома с возрастом достоверно происходит в больших полушариях, нейрогипофизе и гиппокампе (табл. 17).


Очень небольшое, но достоверное изменение количества 5-метилцитозина при старении отмечается и в ДНК мозжечка, а в ДНК продолговатого мозга и ствола оно практически не улавливается. Поскольку формирование условных рефлексов сопровождается индуцированным обратимым суперметилированием ДНК в коре больших полушарий и гиппокампе и, в частности, в нейронах, можно думать, что найденное снижение (нарушение) общего уровня метилирования ДНК коры головного мозга и гиппокампа с возрастом может быть в какой-то степени ответственным за возрастное ослабление функционирования клеток и нарушение памяти.

Выявленное возрастное уменьшение уровня метилирования ДНК в нейрогипофизе может иметь важное значение в искажении транскрипции ДНК в его клетках при старении и в результате может быть ответственным за нарушение нейрогуморальной регуляции всего организма.

Различный характер возрастных изменений уровня метилирования ДНК в разных органах (клетках) согласуется с концепцией Комфорта (Comfort, 1967) о тканевоспецифических механизмах старения. В этом смысле можно, по-видимому, сказать, что, судя по уровню метилирования и функционирования (транскрипции), геном в различных органах и клетках «стареет» по-разному.

Подобно ДНК в нейрогипофизе не лишена известной «печати возраста» ДНК и в других важных секреторных тканях. Так, например, ДНК зобной железы у старых животных существенно менее метилирована, чем у неполовозрелых телят и эмбрионов.

После выявления возрастного уменьшения уровня метилирования генома в разных органах с острой необходимостью возникает вопрос о том, насколько специфично это уменьшение в геноме, затрагивает ли оно хаотично или более или менее равномерно весь геном соответствующих клеток или же оно имеет некий избирательный характер и в большей или меньшей степени избирательно касается каких-то определенных нуклеотидных последовательностей.

Специфичность метилирования ДНК

О специфичности метилирования ДНК можно судить легко по характеру распределения 5-метилцитозина по различным пиримидиновым последовательностям. Для этой цели Зиньковская и соавт. (Зиньковская и др., 1979) изучили содержание 5-метилцитозина в соответствующих пиримидиновых изоплитах и разных по составу пиримидиновых олигонуклеотидах, выделенных из ДНК зобной железы телят и старых коров.

Оказалось, что возрастное уменьшение количества 5-метилцитозина (m5С) в ДНК не хаотично, а довольно специфично. Оно происходит прежде всего в монопиримидиновых последовательностях Pu—m5С—Рu и практически не касается более длинных пиримидиновых олигонуклеотидов (до пентануклеотидов включительно).

Хотя содержание 5-метилцитозина (в мол.%) в динуклеотидах с возрастом значительно не изменяется, относительная доля его здесь несколько даже возрастает за счет падения общего уровня метилирования генома при старении. Поскольку в ДНК зобной железы крупного рогатого скота 5-метилцитозин сосредоточен в основном в последовательности m5C—G, то можно думать, что отмеченное возрастное падение содержания 5-метилцитозина главным образом происходит за счет уменьшения уровня метилирования последовательности Рu—С—G.

Последовательность m5C— G может соседствовать и с длинными пиримидиновыми блоками в виде Pyn—m5C—G, однако в таком сочетании снижения уровня метилирования этой последовательности в пиримидиновых блоках (n > 1) не происходит.

Таким образом, возрастное уменьшение уровня метилирования ДНК в геноме небеспорядочно, а касается определенных участков (последовательностей нуклеотидов). Эти участки (сайты) могут содержаться как в умеренно, так и главным образом в высокоповторяющихся последовательностях.

Именно повторяющиеся последовательности нуклеотидов (преимущественно умеренные повторы) подвергаются обратимому энзиматическому суперметилированию под влиянием гормонов. На основании этого можно предположить, что при старении в основном нарушается метилирование регуляторных генов, находящихся в зоне повторяющихся последовательностей нуклеотидов (Зиньковская и др., 1979).

Механизмы возрастного изменения метилирования ДНК неизвестны. Можно предположить при этом существование как механизма ферментного деметилирования ДНК, так и избирательного вырезания 5-метилцитозина с последующей репарацией ДНК.

Оба эти механизма гипотетически, достаточно вероятны. Если «выстригание» 5-метилцитозиновых нуклеотидов и происходит, то такие бреши в ДНК должны весьма эффективно репарироваться. Известно, что при старении эффективность репаративных систем клетки заметно уменьшается.

Кроме того, при старении акцептирующая способность выделенных препаратов ДНК головного мозга и некоторых других органов млекопитающих увеличивается (Ванюшин, Бердышев, 1977). Это означает, что в старых клетках ядерные ДНК являются недометилированными по сравнению с ДНК соответствующих клеток молодых животных, и, следовательно, они сохраняют метилируемые последовательности.

Возрастные изменения в уровне метилирования ДНК in vivo и акцептирующей способности этих ДНК при метилировании in vitro указывают на то, что функциональное угасание активности генов сопряжено с падением степени модификации генома.

Следовательно, тканеспецифическое возрастное угасание функциональной активности клеток сопряжено с падением уровня метилирования ДНК. Таким образом, процесс старения не минует самого генома, отражаясь в уменьшении и нарушении уровня метилирования ДНК.

Это прежде всего касается ДНК таких важных органов, как мозг и сердце. Возрастное снижение содержания 5-метилцитозина в ДНК сердца (Ванюшин, Бердышев, 1977) коррелирует с резким уменьшением (на 42%) белкового синтеза в сердечной мышце старых животных. Именно последний процесс, по-видимому, ответствен за возрастную утрату клетками сердечной мышцы способности противостоять стрессовым нагрузкам и восполнять утраченные при различных нарушениях белки.

Данные о тканевой специфичности ДНК у животных вообще и о тканевоспецифическом «старении» генома хорошо согласуются с предположением о том, что старение является отдаленным следствием клеточной дифференцировки и, по-видимому, расплатой за нее.

Возрастные изменения физико-химических и биофизических параметров ДНК

Попытки обнаружить возрастные изменения физико-химических и биофизических параметров ДНК не дали однозначных результатов. Гольдштейн (1968) выдвинул концепцию о содержании в нативной ДНК хелатно-связанного железа. Его количество и способы связывания в молекуле ДНК с возрастом меняются, что лежит в основе того, что при извлечении ДНК из тканей пирофосфатом она фрагментируется тем сильнее, чем старее животное.

Оказалось также, что отношение пуринов к пиримидинам в тех фрагментах ДНК, которые извлекаются пирофосфатом, в старости несколько повышается. Исследуя электронно-микроскопическую картину препаратов ДНК печени и тонкого кишечника белых крыс, Герасимова и сотр. (1977) обнаружили, что у старых животных длина изолированных молекул ДНК в среднем меньше, чем у взрослых.

При этом в препаратах ДНК старых крыс в поле зрения появляются отдельные фрагменты ДНК с контурной длиной от 1.5 до 2 мкм, представляющие собой обломки, оторвавшиеся от основной молекулы ДНК старых животных вследствие накопления железа. ДНК из старых тканей отличается также более медленным образованием двунитчатых форм.

Исследования возрастных изменений структуры ДНК дрозофилы в процессе ее старения были выполнены Масси и сотр. (Massie et al., 1975а, 1975b). Исследовав методами скоростной и равновесной седиментации ДНК, выделенную из тканей взрослых мух, они не смогли установить возрастных изменений молекулярной массы денатурированной ДНК (3.02—3.84-10 5 дальтон для всех периодов взрослого развития) и количества сшивок в ней (6.2—8.8% во все возрасты имаго).

Вместе с тем они обнаружили, что молекулярная масса большей части (до 75%) ДНК личинок была около 10 4 дальтон- остальные 25% ДНК личинок имеют молекулярную массу ДНК, близкую к аналогичной массе у взрослых животных (около 10 6 дальтон). Необычно низкая молекулярная масса большей части ДНК, выделенной из тканей личинок, возможно, указывает на большую лабильность и более легкий распад ДНК при ее выделении в самом раннем онтогенезе плодовой мушки.

Некоторое изменение гетерогенности ДНК хроматина печени в первой половине онтогенеза кур было найдено Яковлевым (1970). Боттгер и сотр. (Bottger ei al., 1968) обнаружили, что митохондриальная ДНК печени крысиных эмбрионов имеет константы седиментации, отличающиеся от таковых у ДНК взрослых крыс. Возрастные изменения температуры плавления (Тпл) ДНК тимуса коров как одного из косвенных показателей ее внутренней структурированности исследовал фон Хан (Hahn, von, 1965- Hahn, von, Verzar, 1967).

В начале исследований он установил повышение Тпл у старых животных. Позднее, однако, он нашел, что повышенная Тпл ДНК старых коров в основном зависит от остаточных примесей в ДНК «прочно связанного» гистона- его содержание выше в препаратах ДНК старых животных.

Позднее несколько повышенная Тпл ДНК стареющих животных была установлена Куртцем и Сайнексом (Kurtz, Sinex, 1967). Для ДНК печени мышей было найдено либо полное отсутствие возрастных изменений Тпл, либо лишь очень незначительное ее повышение в старости, при этом полученное лишь в специфических условиях постановки опытов (Russel et al., 1966).

Четсанга и сотр. (Ghetsanga et al., 1977), изучая изменение молекулярной массы ДНК в лизатах клеток мозга молодых и старых мышей, нашли, что с возрастом накопление разрывов в ДНК идет быстрее, чем ее репарация, в результате чего повреждается геном клеток животных, в нем накапливаются нерепарируемые дефекты.

С возрастом в нейронах коры головного мозга кроликов появляются короткие (длиной 162—198 пар оснований) фрагменты ДНК, отсутствующие у эмбрионов и новорожденных животных (Brown, 1978). В опытах Карвонена (1970) было найдено, что при небольшом и приблизительно равном в течение онтогенеза содержании белков в препаратах. ДНК печени белых крыс Тпл и гиперхромный эффект (ГХЭ) в старости несколько повышаются (табл. 18).
Таблица 18. Характеристика препаратов ДНК печени белых крыс разного возраста (Карвонен, 1970)

Возраст, мес	Ер (260)	Е260/Е230	Е260/Е280	Тпл, °С	ГХЭ, %	Содержание белка, % Видео: Степени потери слуха. Как сохранить слух
1	6110	2.15	2.00	85.16	30.6	0.76
3 Видео: Биология. Цитология: Строение клеток прокариот. Бактерии. Центр онлайн-обучения «Фоксфорд»	6195	2.12	2.02 Видео: Омолаживающий массаж лица. Остановить возрастные изменения кожи лица. Уход и красота лица	86.32	32.0	—
12	6226	2.18 Видео: ДЭНАС для коррекции возрастных изменений кожи	2.02	86.4	30.3	—
24	6253	2.20	2.00	88.9	37.8	0.83

Эти результаты были подтверждены в работе Малышко (1977). В отличие от этого не было установлено возрастных изменений Тпл высокополимерной (рибосомальной) РНК печени белых крыс (Никитин, Сагалова, 1969). По данным Стручкова (1962), Стражевской и Стручкова (19(32), с возрастом существенно снижается молекулярная масса выделенной ими сверхполимерной ДНК тимуса крыс.

В отличие от этого отсутствие возрастных различий в равновесном распределении в градиенте плотности Cs2S04 для ДНК из тимуса крыс установили Пытила и Шерман (Pythila, Sherman, 1968). Ачариа и сотр. (Acharya et al., 1972) при специальной обработке тканей печени мозга крыс различными растворителями и протеолитическими феркентами получили олигодезоксирибонуклеопротеиды, ковалентно связанные с пептидами, содержащими в основном аспарагиновую и глутаминовую кислоты.

Молекулярная масса этих компонентов увеличивалась с возрастом. Еще более увеличивалась с возрастом молекулярная масса неэкстрагируемой щелочью фракции этих олигодезоксирибонуклеопротеидов. Прашад и Катлер (Рrаshad, Cutler, 1976) разработали метод выделения ДНК из тканей животных, который позволяет избежать избирательной потери сателлитной ДНК.

С помощью этого метода они обнаружили возрастное увеличение процента извлекаемой из печени мышей сателлитной ДНК (с 7—8% у животных в возрасте 10—60 дней до 12—13% у животных в возрасте 570—788 дней). В мозге и почках возрастных изменений количества извлекаемой сателлитной ДНК не обнаружено- в селезенке — найдено небольшое ее увеличение.

Брэдли и сотр. (Bradley et al., 1976) в ДНК гибнущих от старости культур клеток WI-38 не смогли выявить поперечных сшивок и снижения скорости ее репарации. Джонсон и сотр. (Johnson et al., 1972) методом гибридизации рРНК-ДНК обнаружили значительное (30%) выпадение рибосомальных генов в клетках мозга гончих собак между первым и десятым годами постнатального онтогенеза.

В последующих исследованиях Стрелер и сотр. (Strehler, Chang, 1979- Strehler et al., 1979) нашли потерю гибридизируемой рибосомной ДНК в ряде постмитотических тканей старых людей, причем скорость ее потери у человека с возрастом примерно в 5 раз меньше, чем у собак (т. е. наблюдается обратная корреляция ее с продолжительностью жизни).

Причиной этого может быть возрастное снижение репарации ДНК, но авторы не исключают снижения гибридизируемости рДНК—рРНК из-за образования поперечных сшивок ДНК—белок в хроматине старых людей и собак.