Изменения функций хроматина при старении

С возрастом могут изменяться не только структура генома и белоксинтезирующего аппарата клеток, но и полноценность их функций.

Современное состояние вопроса о «печати возраста» на функциональной способности клеток мы попробуем рассмотреть в этой статье.

Возрастные изменения матричной активности хроматина

Возрастная пессимизация молекулярной структуры генетического аппарата ядер клеток находит свое цитологическое выражение в атрофии, кариолизисе и пикнозе ядер, анэуплоидии и полиплоидии соматических клеток, их патологическом «цепочечном» размножении в мышечных волокнах стареющего организма.

На молекулярном уровне это выражается в нарушении матричного синтеза РНК на ДНК (прямой транскрипции), репликации и репарации ДНК хроматина, изменении синтеза белка. Вместе с тем до сих пор получены далеко еще не однозначные результаты как в исследованиях возрастных особенностей матричной активности хроматина, так и других генетических процессов.

В том случае, когда исследования велись в условиях in vivo, в ряде работ (но не во всех) удавалось установить снижение с возрастом матричной активности хроматина. Так, значительно более интенсивное включение меченных тритием азотистых оснований в РНК тканей мозга 10-дневных крыс по сравнению с таким процессом у взрослых нашли Гарофф и сотр. (Guroff et al., 1968).

Близкие к этому данные получил для ДНК коркового вещества мозга крыс Адаме (Adams, 1966). Шерешевская (1965) обнаружила значительное снижение с возрастом матричной активности хроматина ткани печени белых крыс в условиях in vivo. Менее выраженное возрастное падение матричной активности хроматина ряда органов установил для мышей Мейнуоринг (Mainwarring, 1968, 1969).

По данным Бердышева и сотр. (1976), в хроматине печени крыс происходит весьма выраженное снижение матричной активности хроматина. Однако в работе Самиса и сотр. (Samis et al., 1968) не удалось установить возрастных изменений в способности изолированного хроматина печени белых крыс служить матрицей в синтезе РНК. При этом концентрации хроматина изменялись в 15-кратных пределах, а РНК-полимеразы — в 20-кратных.

Не несла на себе «печати возраста» и скорость включения меченного 14С-урацила в РНК в ДНК-направляемой белоксинтезирующей бесклеточной системе из экстрактов Е. coli в присутствии ДНП печени молодых, зрелых и старых белых крыс (Блок, 1974а, 1974б).

В той же системе синтез белка бактериальными рибосомами в присутствии хроматина печени старых крыс был выше, чем в присутствии хроматина молодых, что, возможно, связано с синтезом в старости большего процента долгоживущей мРНК. Изменение при старении спектра синтезируемых на ДНК РНК было показано Катлером (Cutler, 1972) и Мурадяном (1977).

Было установлено, что уровень синтеза РНК изолированными ядрами клеток печени белых крыс в среде с низкой ионной силой и Mg2+ (т. е. в условиях проявления активности рибосомальной РНК-полимеразы) с возрастом снижался, а в среде с высокой ионной силой и Мn2+ (т. е. в условиях проявления активности матричной РНК-полимеразы) снижения от зрелости до старости не наблюдалось, при достоверном максимуме активности у трехлетних животных.

Отсюда можно заключить, что в старости падает синтез рРНК и в значительной степени сохраняется синтез мРНК (Блок, 1974а, 19746). В условиях in vivo синтез различных фракций РНК в тканях печени белых крыс выявляет более выраженное возрастное падение (Тупчиенко, 1972). Это падение неравномерно выражено в разных фракциях РНК.

Особенно значительно падает с возрастом скорость новообразования лабильной мРНК (Д-РНК), т. е. той части информационной РНК, которая «обслуживает» потребности самого ядра (хроматина) клетки, в частности является участником созревания и транспорта мРНК. В том же направлении выполнено исследование Бертольдом и Лимом (Berthold, Lim, 1976).

Они обнаружили, что в мозге у 3-дневных крысят значительная часть новосинтезированной меченой РНК переносится из ядра в цитоплазму, тогда как у взрослых (150-дневных) крыс происходило интенсивное внутриядерное обновление РНК. Основная часть процессинга предшественника рибосомальной РНК у молодых животных тесно связана с транспортом РНК в цитоплазму, в то время как у взрослых крыс процессинг предшественника на рибосомальную РНК 28S и 18S протекал в ядрах значительно более интенсивно.

Меняются с возрастом и скорость синтеза, и активность А- и Б-форм РНК-полимеразы ядер клеток печени белых крыс (Зильберман, Паскевич, 1976). Оказалось, что РНК-полимераза А (ядрышковая),- ответственная за синтез рРНК, быстрее синтезируется в ядрах клеток печени в ранней зрелости (3-месячный возраст) с последующим падением к старости- РНК-полимераза Б (нуклеоплазматическая), ответственная за синтез мРНК, достигает максимальной скорости синтезирования тоже в 3-месячном возрасте, но затем сохраняет этот высокий уровень до старости.

Активность очищенных форм РНК-полимераз меняется с возрастом неодинаково- РНК-полимераза А достигает максимальной активности в ранней зрелости с последующим падением к старости- активность РНК-полимеразы Б с возрастом не изменяется. Это совпадает с данными в исследовании Блок и сотр. (1974а, 19746): к старости падает синтез рРНК, но мало меняется интенсивность синтеза мРНК.

Репарация и старение

Вопреки кажущимся различиям современных теорий старения многие из них основываются на предположении о том, что возрастная модификация генетического материала — существенный фактор старения. Многие виды возрастных изменений структуры генетического аппарата клеток могут быть выражением возрастного накопления нерепарирующихся повреждений ДНК.

По мнению Барнета (Burnet, 1978), в основе процессов старения лежит накопление с возрастом мутационных нарушений систем репарации и репликации ДНК. Впервые идею о важной роли нарушения репарации ДНК в развитии процессов старения высказал в 1967 г. Александер (Alexander, 1967). Он считает, что процесс дифференциации, при котором клетки становятся постмитотическими, связан с ослаблением репаративных систем.

С возрастом количество повреждений ДНК накапливается, но сначала это не влияет на высокоспециализированную функцию клеток. Вскоре степень фрагментации ДНК становится ощутимой, ослабевает синтез РНК, и клетки погибают. В известном смысле это может быть одним из механизмов запрограммированной гибели клеток. Эта концепция была широко развита Виленчиком и сотр. (1979).

Интересную модель старения, основанную на дифференциальной репарации, предложил Илдинг (Ielding, 1974). Согласно Илдингу, репарация повреждений, вызывающих мутации, может осуществляться лишь в тех участках ДНК, которые вовлечены в активные процессы транскрипции и. физически доступны для ферментов, в том числе репарационных.

Это явление автор называет дифференциальной репарацией, которой, по его мнению, принадлежит существенная роль в процессах старения. Благодаря дифференциальной репарации в активных участках ДНК дифференцирующихся клеток накапливается существенно меньше повреждений, чем в неактивных участках, охватывающих большую часть генома и физически заблокированных на протяжении большей части клеточного цикла.

Нерепарированные повреждения ДНК неактивных участков хромосом вызывают нарушения репликативного синтеза ДНК и как следствие — нарушения клеточного цикла, деления и удлинения клеточного цикла, а также возникновения хромосомных аберраций. До репликации эти повреждения могут не проявляться, так как в процессе транскрипции неактивные участки ДНК не считываются.

Активные участки ДНК также могут служить мишенью повреждающих воздействий, но относительная роль этих повреждений незначительно меньше, во-первых, благодаря относительно меньшему числу активных участков в геноме по сравнению с неактивными, а во-вторых, благодаря репарируемости таких повреждений. Значение повреждений активных и неактивных участков ДНК может быть различным для последующей судьбы клеток.



Повреждения различных неактивных участков феноменологически должны проявляться сходным образом, и популяция клеток, несущих такие повреждения, будет выглядеть однородной, так как во всех этих клетках будет повреждена репликативная способность со всеми перечисленными последствиями.

С течением времени повреждения должны приводить к накоплению в тканях клеток с хромосомными аберрациями, а также увеличением средней продолжительности клеточного цикла, что имеет место в действительности. Повреждения активных участков ДНК (активных генов) также должны играть определенную роль в процессе старения, но, по-видимому, не такую, как при повреждении неактивных генов.

Клетки с мутантными активными генами могут накапливаться в клеточных популяциях лишь в том случае, если эти мутации не уменьшают их жизнеспособности, и тогда эти повреждения могут не вызывать изменений функциональных особенностей, тканей. Виллер и Летт (Wheeler, Lett, 1974), рассматривая случаи, в которых отсутствует репарация клеток, отмечают: существует обоснованное предположение, что все клетки млекопитающих в норме обладают репарирующей способностью.

Исключение составляют клетки, потерявшие способность восстанавливать нарушение структуры ДНК, что проявляется лишь в особых случаях- таким исключением, во-первых, могут быть клетки преждевременно стареющего (прогероидного) организма. Второе исключение касается митотической популяции клеток яичника китайского хомяка после интенсивного облучения. Третьим исключением могут быть клетки при нормальном старении.

Значение репаративных систем для старения при заболеваниях

Особенно ярко значение репаративных систем для старения проявляется при ряде заболеваний, когда у больных отсутствует репарация тех или иных повреждений. Показано, что фибробласты кожи больных с неклассическим синдромом Гетчинсона—Гилфорда (такие больные обычно быстро старятся) обладают меньшей способностью соединять поврежденные радиацией цепи ДНК.

Эти диплоидные клетки, полученные из тканей детей, жизнеспособны только в течение 9 генераций. В то время как разрывы, индуцированные в диплоидных клетках человека у-облучением, восстанавливаются в течение 30 мин после облучения, в клетках этих больных они не восстанавливаются совсем.

Преждевременное старение отмечено при таком заболевании, как пигментная ксеродермия, когда нарушена система эксцизионной репарации. Фибробласты, взятые у таких больных, переживают меньшее число пассажей, чем нормальные клетки. Они отличаются по скорости репарационных процессов от клеток нормальных людей.

Так, если в клетках здоровых людей процесс репаративной репликации длится 6 ч, то в клетках больных он затягивается до 30 ч, не достигая уровня нормального репаративного синтеза (Жестянников, 1979- Виленчик и др., 1980).

Имеются данные о том, что активность репарируемых систем клетки в норме зависит от возраста, хотя и здесь получены неоднозначные результаты. С увеличением возраста клеток их способность к восстановлению значительно ослабевает.

Так, по мере пассирования культуры диплоидных клеток человека (продолжительность их инкубации составляет около 50 пассажей) прогрессивно падала способность вырезать из ДНК тиминовые димеры, образующиеся после УФ-облучения (Дубинин, Засухина, 1975). Интересно отметить, что концентрация ферментов, участвующих в фотореактивации повреждений ДНК ультрафиолетом, в фибробластах эмбриона значительно больше, чем в фибробластах взрослой курицы.

Показано, что мыши долгоживущих линий обладают более стабильными хромосомами, тогда как хромосомы мышей с короткой продолжительностью жизни (ПЖ) менее стабильны (Curtis, 1964). У собак, живущих значительно дольше мышей, интенсивность развития хромосомных аберраций намного ниже, чем у мышей. По мнению Катлера (Cutler, 1972), ПЖ клеток определяется скоростями процессов повреждения и репарации ДНК.

Результаты собственных исследований и данные литературы позволили Виленчику (1970) предположить, что эффективность репарации генетических повреждений снижается при старении различных клеток и в процессе программированной смерти диплоидных штаммов фибробластов. Харт и Сетлоу (Hart, Setlow, 1974) обнаружили корреляцию между размерами эксцизионной репарации и продолжительностью жизни.

Они показали, что в норме уровень репаративного синтеза ДНК у ряда видов млекопитающих после облучения увеличивается соответственно ПЖ. Для мыши, хомяка, коровы и человека была обнаружена связь между величиной репарационного синтеза на клетку и эксцизионной репарацией на единицу длины молекулы ДНК.

Корреляция между активностью эксцизионной репарации и продолжительностью жизни Хартом и Сетлоу была установлена для 7 видов млекопитающих. Образование злокачественных опухолей в старом организме может быть следствием того, что старение клетки связано с ослаблением активности репарационных процессов (Виленчик, 1970).

Однако в литературе имеются данные, ставящие под сомнение сам факт ослабления репарационных систем клетки с возрастом (Жестянников, 1979). Так, в диплоидных клетках фибробластов человека поздних пассажей репарация повреждений ДНК, вызванных радиацией, и молекулярная масса совпадают с таковыми у молодых клеток.

Сниженный уровень репаративного синтеза при УФ-повреждениях ДНК удалось обнаружить только на самом последнем пассаже перед полным прекращением роста культуры клеток. Это уменьшение не имело места за 2 пассажа перед этим, на основании чего было сделано заключение, что снижение эксцизионной репарации не является основной причиной старения диплоидных фибробластов человека (Painter et al., 1973- Clarkson, Painter, 1974).

В линиях культур фибробластов кожи человека с нормальной чувствительностью к солнечному свету скорость внепланового синтеза ДНК в клетках старых доноров была идентичной с таковой у молодых доноров на одинаковой стадии пассирования. Очевидно, репарация ДНК при УФ-облучениях не имеет отношения к процессу старения в клетках (Kawakita, 1972).

Сравнение профилей седиментации ДНК показало, что, хотя размеры ДНК, экстрагируемой из нейронов внутреннего гранулярного слоя мозжечка собаки, уменьшаются с возрастом, возрастное влияние на кинетику соединения разрывов ДНК, вызванных облучением, не выявлено (Wheeler, Lett, 1974). Это согласуется с данными Прайса и сотр. (Price et al., 1971).

Правда, авторы в опыте использовали животных не старше 10 лет, тогда как собаки данной породы гончих живут в среднем 14 лет. Поэтому еще не ясно, происходит ли потеря репаративной способности ДНК на заключительных этапах старения. Не удалось обнаружить различий в размерах повреждений или восстановления повреждений у старых и молодых мышей.

Исходя из этого, Куртис (Curtis, 1964) считает, что хромосомные репарационные механизмы активны даже в очень старом организме. Культуры фибробластов людей с прогерией и болезнью Ротмунда—Томсона (синдром, связанный с преждевременным старением) обладают более короткой выживаемостью, хотя у них восстановление ДНК такое же, как и у нормальных фибробластов (Yukas, 1971).