Старение в клеточных культурах. Предел клеточных делений

Видео: замеряем теломеры или как прожить дольше FINITI от Jeunesse

Существует ли предел клеточных делений?

Идея о том, что клетки животных способны совершить лишь ограниченное и строго определенное число делений, была высказана еще в 1882 году Вейсманом (Weismann, 1882), подробно обсуждалась Мечниковым (1907), а в настоящее время получила экспериментальные подтверждения (Micklem et al., 1975- Reincke et al., 1975- Botnick et al., 1976) и стала основой ряда теорий старения (Olovnikov, 1973- Holliday, 1975).

«Старение» клеточных культур часто рассматривают как основное доказательство ограниченной способности клеток к делению (Marx, 1974- Reincke et al., 1975- Hirsch, 1977).

Действительно, установлено, что репликативное старение многих клеточных культур происходит только при делении клеток и не связано непосредственно с интенсивностью их метаболизма.

Например, если временно подавить клеточное деление в культурах фибробластов человека (понижением температуры, уменьшением концентрации сыворотки крови в культуральной среде, повышением плотности популяции), а затем снова создать условия для роста, то в таких культурах репликативная гибель наступает позднее на срок, равный времени нахождения культуры в непролиферируюгцем состоянии.

При этом число удвоений, совершенных клеточной популяцией, не меняется (см.: Гаврилов, Гаврилова, 1978). Поэтому «возраст» и «продолжительность жизни» клеточных культур следует определять не через календарное время, а через число делений, совершенных клетками (так называемое митотическое время) (Dell Orco 1974- Goldstein, Singal, 1974- Гаврилов, Ягужинский, 1978).

Практически митотическое время выражают через число пересевов (пассажей), полагая, что один пассаж в отношении 1 : 2 соответствует одному удвоению популяции (Cristofalo, 1972- Goldstein, 1974), а одно удвоение — одному делению клеток культуры (Marx, 1974).

Например, культура эмбриональных диплоидных фибробластов человека способна выдержать около 50+10 пересевов в отношении 1 : 2 (Hayfiick, 1965)- поэтому считают, что данная культура совершает 50 удвоений популяции (Hayfiick, 1969- Cristofalo, 1972), а клетки этой культуры способны поделиться 50 раз (Marx, 1974- Дубина, Разумович, 1975).

Однако известно, что многие клетки в организме (например, клетки слизистой кишечника, кожи, кроветворные и лимфоидные клетки) способны делиться значительно больше 50 раз (Дубина, Разумович, 1975- Cameron, Thrasher, 1976- Hirsch, 1977). Это несоответствие породило сомнения в возможности применения клеточных культур для моделирования возрастных изменений, происходящих в организме (Cristofalo, 1972- Cameron, Thrasher, 1976).

Оказалось, однако, что причина данного противоречия кроется в неправильном расчете числа удвоений и делений. Во-первых, было обнаружено, что через сутки после пересева культуры фибробластов человека в живых остается только 50—70% клеток репликативно молодой культуры (Cristofalo et al., 1970) и всего 25% клеток репликативно старой культуры (Good, 1972).

Поэтому 40—60 пассажей (кажущихся удвоений) соответствуют 80—120 истинным удвоениям популяции (с учетом гибели клеток) (Good, 1972). Во-вторых, не все фибробласты, пережившие операцию пересева, способны делиться, причем доля делящихся клеток сильно уменьшается при репликативном старении (см. выше). С учетом этого факта и постоянной гибели клеток было рассчитано, что 40—60 пассажей культуры фибробластов человека соответствуют 120—160 делениям клеток (Good, 1972- Hirsch, 1977).

Согласно другому, более точному расчету эта величина составляет 170+30 делений (Гаврилов, Ягужинский, 1978). В-третьих, обнаружено, что в «мертвых» культурах фибробластов человека еще остается 10—20% клеток, способных делиться (Cristofalo, Sharf, 1973- Milo, Hart, 1976)- поэтому вообще нет никаких оснований говорить о существовании предела числа делений у всех клеток культуры.

Более того, анализ кинетики роста культуры фибробластов человека показал, что абсолютное число делящихся клеток в расчете на всю популяцию фибробластов (т. е. с учетом операции пересева) никогда не уменьшается, а в конце «жизни» культура растет в основном за счет образования неделящихся клеток. Это означает, что репликативное старение культуры вызвано не исчезновением делящихся фибробластов, а их разбавлением неделящимися клетками (Гаврилов, Ягужинский, 1978).

Следовательно, культура может иметь ограниченную «продолжительность жизни» даже в том случае, если часть ее клеток делится неограниченно. В качестве конкретного примера рассмотрим модель, основанную на схеме, предложенной ранее (Osgood, 1959) для клеток кроветворной системы организма.

Согласно этой модели, в культуре фибробластов человека существует 2 типа делящихся клеток: n-клетки, которые способны совершить ограниченное число делений (около 100), превращаясь затем в неделящиеся, и а-клетки, которые делятся неограниченно, причем из а-клеток постоянно образуется некоторое количество n-клеток.



В простейшем случае эти условия выполняются, если а-клетки делятся асимметрично, образуя одну клетку, идентичную родительской (а-клетку), а другую — относящуюся к категории n-клеток. В настоящее время асимметричность деления считается характерным свойством большинства клеток в организме (Hirsch, 1977).

При таком асимметричном делении число а-клеток не может увеличиваться. Нетрудно заметить, что по данной модели разбавление популяции неделящимися клетками является неизбежным, поэтому культура клеток будет иметь ограниченную «продолжительность жизни» даже в том случае, если вначале она полностью состоит из «бессмертных» а-клеток.

Действительно, оказалось, что эта простая модель позволяет качественно описать кинетику репликативного старения культуры фибробластов человека (Гаврилов, Ягужинский, 1978).

Возможные механизмы репликативного старения клеточных культур

В настоящее время конкретные механизмы репликативного старения клеточных культур неизвестны, а имеющиеся многочисленные предположения можно свести к двум обобщенным гипотезам. Концепция накопления нарушений, повреждений или ошибок рассматривает процесс репликативного старения как результат несовершенства различных внутриклеточных систем, например системы переноса генетической информации.

Согласно гипотезе переключения, репликативное старение — это процесс квазидифференцировки клеток культуры, аналогичный дифференцировке клеток в организме (Гаврилов, Гаврилова, 1978).

Среди многих гипотез накопления нарушений большое распространение получила гипотеза «катастрофы ошибок» Оргела (Orgel, 1963- Holliday, 1975), согласно которой на уровне трансляции накапливаются ошибки, приводящие к дальнейшему уменьшению точности работы систем переноса генетической информации.

Однако при анализе экспериментальных подтверждений гипотезы Оргела выясняется, что ни одно из них не доказывает справедливости этой гипотезы (Гаврилов, Гаврилова, 1978). Наиболее серьезным опровержением гипотезы накопления повреждений являются результаты экспериментов по заражению репликативно молодых и старых культур вирусами герпеса (Holland et al., 1973- Hayfiick, 1974), везикулярного стоматита (Holland et al., 1973- Pitha et al., 1974) и полиовирусом (Holland et al., 1973- Hayfiick, 1974- Pitha et al., 1974).



В этих работах вирусная инфекция была использована как метод оценки состояния клеток репликативно старых культур. Основное достоинство вирусного теста заключается в том, что он позволяет охарактеризовать общее состояние клетки и выявить нарушения независимо от их конкретной природы.

Кроме того, этот метод чувствителен, так как позволяет обнаружить влияние аналогов аминокислот и плотности популяции на состояние клеток (Pitha et al., 1975). Так, например, оказалось, что ничтожные добавки аналогов аминокислот, снижающие скорость роста культуры всего на 20%, приводят к 5—10-кратному снижению числа инфекционных вирионов, образующихся из одной клетки (Danner et al., 1978).

Если репликативное старение действительно вызвано накоплением нарушений в клетках, то вирусный тест выявил бы следующие изменения в клетках «старых» культур: снижение скорости образования и созревания вирусов, уменьшение количества вирионов, образующихся на одну клетку, падение удельной инфекционности вирусов и повышение их термолабильности, увеличение доли мутантных вирусов и изменение электрофоретического спектра вирусных белков.

Однако ни одно из этих изменений обнаружено не было (Holland et al., 1973- Hayfiick, 1974- Pitha et al., 1974, 1975). Это означает, что при репликативном старении не происходит заметного снижения точности работы систем переноса информации и падения синтезирующих возможностей клеток.

В последнее время все большее признание приобретает гипотеза дифференцировки клеток в культуре, согласно которой репликативное старение вызвано переключением клеточного метаболизма в режим, несовместимый с делением (Finch, 1976- Rheinwald, Green, 1977- Bell et al., 1978).

Эта гипотеза хорошо согласуется со счетом делений, происходящим при репликативном старении. Действительно, на самых разных объектах было показано, что для переключения метаболизма часто необходимо клеточное деление, причем критический пункт в таком переключении совпадает с синтезом ДНК. Поэтому гипотеза дифференцировки хорошо согласуется с тем, что «запоминание» числа делений при репликативном старении происходит в ядре.

По-видимому, здесь мы сталкиваемся с универсальным механизмом переключения метаболизма, который пока не изучен (Truman, 1976- Гаврилов, Гаврилова, 1978). Гипотеза дифференцировки предсказывает, что гибридная клетка, образованная из пострепликативной и трансформированной клеток, должна быть способна к делению. В самом деле, оказалось, что гетерокарион пострепликативных фибробластов человека с гетероплоидными клетками золотистого хомячка способен совершить более 100 клеточных генераций (Goldstein, Lin, 1972).

Показано также, что ядра пострепликативных фибробластов человека после гибридизации с клетками HeLa или с трансформированными фибробластами человека начинали синтезировать ДНК (Norwood et al., 1975). Обнаружено, что репликативное старение культур фибробластов человека связано с исчезновением мРНК негистоновых ядерных белков, участвующих в активации генома при клеточном делении (Stein, Burther, 1975).

Это явление хорошо объясняется, если учесть следующие экспериментальные факты: при репликативном старении изменяется спектр ядерных белков, и это изменяет структуру хроматина так, что его матричная активность в отношении синтеза РНК уменьшается (Baserga, Nicolini, 1976). Следовательно, репликативное старение можно рассматривать как процесс переключения активности генома, т. е. как процесс дифференцировки.

В отличие от концепций накопления повреждений гипотеза дифференцировки легко согласуется с фактами о неуниверсальной распространенности репликативного старения, обратимости перехода в пострепликативное состояние, высокой точности и скорости биохимических процессов в пострепликативных клетках и низкой скорости гибели этих клеток.

Наконец, было прямо показано, что ограниченная «продолжительность жизни» культур эпидермальных кератиноцитов человека связана с дифференцировкой этих клеток (Rheinwald, Green, 1977). Что касается фибробластов, то известно, что эти клетки могут дифференцироваться в культуре с образованием неделящихся адипоцитов (Portugal, 1979).

Возможно, что этот процесс и лежит в основе репликативного старения фибробластов, но недостаточность культуральной среды по ряду факторов (например, биотину) мешает нормальной экспрессии нового фенотипа. Таким образом, хотя гипотеза дифференцировки клеток в культуре окончательно не доказана, она значительно лучше соответствует имеющимся экспериментальным данным, чем концепция накопления нарушений.

Соотношение между старением многоклеточных организмов и клеточных культур

Интерес геронтологов к самому явлению «старения» клеточных культур во многом определяется тем, насколько оно связано со старением организмов. Определенное соответствие между двумя этими явлениями действительно существует (Cristofalo, 1972- Hayfiick, 1977- Гаврилов, Гаврилова, 1978).

Например, установлено, что репликативная продолжительность жизни клеточных культур уменьшается с увеличением возраста донора клеток (Schneider, Chase, 1976- Schneider, Mitsui, 1976). Кроме того, «продолжительность жизни» клеточных культур, полученных от разных животных, коррелирует с продолжительностью жизни этих животных (Hayfiick, 1975).

Однако эти факты вовсе не доказывают, что в основе старения организма лежит ограниченная способность его клеток к делению. Если бы это было так, то все нормальные клетки животных имели бы ограниченную «продолжительность жизни» в культуре.

На самом же деле существует ряд культур клеток животных, способных в неограниченному росту (Cristofalo, 1972- Finch, 1976). Возражение Хейфлика (Hayfiick, 1977), что такие клетки могли иметь отклонения от нормального диплоидного кариотипа, в настоящее время не может быть принято, поскольку в «стареющих» культурах фибробластов человека диплоидный кариотип также не сохраняется.

Действительно, репликативно старые фибробласты человека содержат 6% полиплоидных и 43% анэуплоидных клеток (Thompson, Holliday, 1975). С другим утверждением Хейфлика, что неограниченная способность к делению характерна только для трансформированных клеток (Hay-flick, 1965), также нельзя согласиться.

Например, нормальные клетки имагинальных дисков дрозофилы способны к неограниченному росту (Finch, 1976). С другой стороны, культура фибробластов цыпленка, трансформированных вирусом саркомы Рауса, имеет ограниченную репликативную продолжительность жизни (Ponten, 1970- Leblond-Larouche, Morais, 1976).

Таким образом, ни трансформация, ни изменение кариотипа не имеют прямого отношения к «старению» клеточных культур.

Исследование «старения» клеточных культур позволяет выяснить причины снижения митотической активности и механизмы регуляции клеточного деления. Это может быть полезным в изучении закономерностей снижения регенераторных возможностей и атрофии тканей при старении организма.