Экспериментальные подходы к продлению жизни. Связывание белковых молекул

Применение веществ, препятствующих перекрестному связыванию белковых молекул

Нарастающую при старении «пессимальную структуризацию» молекул белков и нуклеиновых кислот как один из ведущих факторов онтогенеза для молекулярного уровня организации жизни принимали в теории затухающего самообновления протоплазмы Нагорный (1940), Никитин (1940, 1954), Буланкин и Парина (1962).

Специально по отношению к поперечному «сшиванию» белковых молекул как ведущему фактору онтогенеза такую теорию развили Бьёркстен и соавт. (Bjorksten, 1958, 1971- Bjorksten et al., 1962), Оэриу и соавт. (Oeriu, 1962- Oeriu, Oeriu, 1968), Сайнекс (Sinex, 1965), Ла Белла и Пуаль (La Bella, Paul, 1965)- Леонов и Дубина (1966, 1971).

Бьёркстен (Bjorksten, 1958) в модельных экспериментах нашел, что целый ряд присущих организму метаболитов и неорганических веществ может вызвать поперечную сшивку белковых молекул (в частности желатины).

К ним принадлежат ацетальдегид, метилгуанидин, а-кетоглутаровая кислота, пировиноградная, лимонная, фумаровая, янтарная и малоновая кислоты, т. е. компоненты окислительного (трикарбонового) цикла Кребса, медь, железо, магний, цинк, алюминий и свинец.

Уже перечисление этих веществ показывает, что они — обязательно присущие обмену веществ и составу крови компоненты, концентрация которых мало меняется с возрастом. Это снижает вероятность того, что именно им принадлежит ведущая роль в присущем старости пессимальном ассоциировании белковых молекул.

К этому следует прибавить, что сама ассоциация в решающей части не спонтанный процесс, зависящий только от свойств белковых молекул, а прежде всего ферментативно управляемый процесс (Никитин и др., 1977). Оэриу (Oereu, 1962) главной связью между белковыми молекулами считал дисульфидные мостики и соответственно рекомендовал для продления жизни применение метионина и цистеина.

Наконец, Леонов и Дубина (1966, 1971) рассматривали как очень важный фактор поперечного сшивания белков ионы переходных металлов. Отсюда их рекомендация (Дубина, Разумович, 1975) применять комплексоны как факторы геротерапии.

Применение латирогенов

Особое место в теориях «сшивок» отводится доминирующему опорному белку соединительной ткани — коллагену (Богомолец, 1940- Sobel, Marmorston, 1956- Bjorksten, 1958). Для него было с достаточной степенью достоверности установлено возрастное нарастание поперечных сшивок (La Bella, Paul, 1965- Piez, 1968- Никитин и др., 1977).

Ряд исследователей применили для устранения избыточного поперечного связывания молекул коллагена известные в медицине латирогены (вещества, разрывающие межмолекулярные связи коллагена). Кон и Лиш (Kohn, Leach, 1967) использовали с этой целью в-аминопропионитрил. Оказалось, что в примененных дозах препарат не увеличивал продолжительности жизни крыс и в первый год жизни необратимо угнетал рост животных. Пока не получено положительных результатов и с другим латирогеном — а-пеницилламином (Comfort et al., 1971).

Выяснилось только, что пеницилламин, вводимый в течение 2 недель в пищу крыс в количестве 0.25% от массы тела, значительно повышает долю растворимого коллагена в коже и подкожной гранулеме этих животных, что рассматривалось авторами как признак его дефектности. Основным ограничением в применении латирогенов как геропротекторов следует считать всеобщность и обезличенность их действия на все виды коллагена организма.

Между тем далеко не всякое структурное образование в организме, в котором принимает участие коллаген, нуждается в его обезличенном разрыхлении и солюбилизации. Именно поэтому латиризм — крайне нежелательное нарушение в структуре соединительной ткани, проявление патологии, а не физиологии.

Применение комплексонов (хелатных агентов)

Применение хелатных веществ, связывающих переходные металлы, лежащие в основе пессимальной в старости структуризации белковых и нуклеиновых комплексов, было впервые предложено Дубиной и Леоновым (Дубина, Леонов, 1968- Дубина, 1971- Леонов, Дубина, 1971). Вместе с тем еще ранее Бьёркстен (Bjorksten, 1958) и Лансинг (Lansing, 1951) принимали ряд ионов металлов (или кальций) за факторы перекрестного связывания белковых молекул.

В перекрестном связывании, при участии переходных металлов, могут образовываться комплексы белков с фосфолипидами (Fullington, Hendrichson, 1966), а также тройные комплексы типа связывания глицина с сывороточным альбумином при посредстве цинка (Gurd, Wilcox, 1956). Лансинг (Lansing, 1942) попытался ослабить сшивающее действие кальция на белки протоплазмы, изучая продолжительность жизни (ПЖ) коловраток, помещаемых периодически в слабый раствор цитрата.

В его исследованиях это приводило к некоторому продлению их жизни. Очень широко в ряде тщательных исследований изучила действие этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) на продолжительность жизни крыс Дубина (1970, 1975). Во всех этих опытах, за редким исключением, не было получено обнадеживающих результатов. Не дали благоприятного результата и опыты Дубиной (1975) с применением других хелатных агентов — унитиола (2,3-димеркаптопропансульфоната натрия) и пеницилламина (диметилцистеина).

Применение факторов, уменьшающих сшивки белковых молекул по дисульфидным мостикам

Рекомендации применения содержащих сульфгидрильные группы веществ (цистеина, метйонина и др.) как средства размыкания дисульфидных мостиков в гиперструктурированных стареющих белковых молекулах выдвинуты Пархоном и сотр. (Parhon et al., 1961) и особенно Оэриу (Oeriu, 1962- Oeriu et al., 1968). В этих исследованиях для ряда тканей лабораторных животных было показано некоторое нарастание с возрастом дисульфидных мостиков в белках.

Исходя из этого, Оэриу рекомендовал обогащение рациона пожилых людей метионином, цистеиноми фолиевой кислотой (витамином группы В). Предложенный им комплексный препарат называется фолупетаином. В более поздней работе Никитина и соавт. (1977) установлено, что нарастание с возрастом дисульфидных мостиков присуще далеко не всем группам тканевых белков и не для всех тканей.

Высказано предположение, что нарастающие с возрастом пессимальная структуризация и ассоциированность белковых молекул могут осуществляться не только по дисульфидным сшивкам. Однако в тех белках, где эти сшивки, исходя из структуры молекул, возможны (гемоглобин, кератины и сывороточный альбумин), удается показать нарастающую с возрастом сшивку по дисульфидным мостикам.



Пути воздействия на геном и белоксинтезирующий аппарат клетки

Искания в этой области несомненно в перспективе оказались бы наиболее плодотворными и на молекулярном уровне организации протоплазмы фундаментально решающими проблему экспериментального продления жизни и в целом управления возрастным развитием организма.

Задачи, которые может ставить здесь экспериментальная геронтология, могут быть сгруппированы следующим образом:

а) попытки защиты (экранирования) генома клетки от вредящих и искажающих процессы нуклео- и протеосинтеза воздействий факторов (физических и химических) окружающей его внутриклеточной и внеклеточной среды;
б) стимуляция процессов и ферментных систем, репариирующих возникающие возрастные повреждения и «подвоз» к клеткам и тканям исходных веществ для синтеза и починки ДНК;
в) предохранение генома от, возможно, возникающих в процессе его функционирования (транскрипции РНК) явлений «изнашивания»;
г) активное вмешательство в самую структуру генома, его макромолекулярный состав и включение в молекулы ДНК (генный набор) новых генов и их комплексов с целью внесения в «программу возрастного развития» организма новых, повышающих «запас его прочности» и удлиняющих жизнь организма признаков и групп признаков. Такие воздействия могут осуществляться методами генной инженерии и генотерапии.

Первый путь воздействий на геном клетки — его предохранение от вредных воздействий. Одним из наиболее разрушающих структуру генома (ДНК хромосом) факторов Виленчик (1976) считает тепловое движение молекул воды. К сожалению, с большой осторожностью предложенное Виленчиком (1976) для продления жизни снижение температуры тела на 2—3°, которое могло бы, по его расчетам, продлить жизнь гомойотермных животных на 20—25%, по понятным соображениям, вряд ли может иметь реальное применение.

По отношению к пойкилотермным животным снижение температуры в некоторых случаях приводило к продлению жизни (Виленчик, 1970, 1976), однако пока что неясно, каков его механизм.

Второй путь воздействий на геном клетки — стимуляция процессов репарации и процессов синтеза нуклеиновых кислот и белков прибавлением специфических ферментов и регуляторов и исходных для синтеза ДНК и белков генома веществ начинает интенсивно разрабатываться.

Для низших организмов (бактерий) найдейо более 10 генов, определяющих активность репаративных ферментов (Засухина, 1973). Репарации широко развиты в клетках эукариотов, хотя, по-видимому, их эффективность несколько менее выражена, чем у прокариотов.



Впервые концепцию о существенной роли нарушений в репарационных способностях клеток и организмов в целом для сокращения их жизни развил Александер (Alexander, 1967). По Катлеру (Cutler, 1972) и Виленчику (1972), видовая ПЖ клеток определяется соотношением скоростей повреждения и репарации ДНК генома.

Для ряда долго- и короткоживущих видов млекопитающих Харт и Сетлоу (Hart, Satlaw, 1974) показали эту зависимость экспериментально. В процессах репарации ДНК генома клетки решающую роль играют осуществляющие ее ферменты. К ним относятся группа специфических эндо- и экзонуклеаз, полинуклеотидлигазы, РНК- и ДНК-полимеразы и т. д.

В ряде исследований предпринимались попытки стимулировать образование этих ферментов или введение их в состав клетки. Некоторые виды ДНК-аз, относящиеся к репариирующим ферментам, способны проникать в клетки млекопитающих. В ряде исследований было показано, что низкие дозы ультрафиолетового и ионизирующего излучений могут оказывать стимулирующее действие на синтез ДНК и репариирующих ее ферментов.

Была установлена стимуляция синтеза ДНК в уже дифференцировавшихся мышечных клетках позвоночных животных. По-видимому, благодаря усилению синтеза ДНК генома и ее репарации была продлена жизнь некоторых низших животных с помощью малых доз ионизирующих излучений (см. сводку: Ванюшин, Бердышев, 1977).

В бактериальных клетках с помощью ультрафиолетового облучения происходит образование (мобилизация — В. Н.) особой, так называемой аварийной (SOS) ферментной системы репарации ДНК. Функции этой системы — устранять во время делений накопившиеся в геноме «ошибки» методом рекомбинации. В животных клетках эти механизмы функционируют преимущественно во время мейоза, и это открывает новые возможности ультрафиолетовой стимуляции «исправления» генетической программы стареющих клеток тканей (см. сводку: Виленчик, 1976).

Попытки стимулировать общую активность стареющего генома клетки пока что не дали существенных результатов. Одним из средств такого воздействия была дача в питательную среду тканей или в пищу целостным животным организмам экзогенных РНК и ДНК или их отдельных компонентов.

По отношению к культурам тканей Бердышев (1968) при прибавлении гетерологической РНК обнаружил даже повреждение клеток в культурах тканей высших позвоночных животных, а при добавлении суммарной РНК печени к фибробластам куриного зародыша никаких изменений в их развитии не наблюдал. Было получено некоторое повышение жизнеспособности при введении нуклеиновых кислот в организм мышей, крыс и кроликов.

Однако продолжительность жизни подопытных животных при этом не исследовалась. У некоторых беспозвоночных животных (Drosophila melanogaster) препараты ДНК, по-видимому, способствуют увеличению ПЖ (Бердышев и др., 1965, 1976- Бердышев, Карпенчук, 1977). За последнее время было показано (Szabuniewicz, 1977), что свободные фрагменты ДНК, вводимые в организм животных (Drosophila melanogaster), сравнительно легко включаются в геном клеток организма.

Эти данные делают в какой-то степени вероятным непосредственное действие, «осколков» молекулы ДНК на ПЖ организма. Вызывает интерес «омолаживающее» действие на ЦНС центрофеноксина — вещества, близкого по молекулярной структуре к растительным ауксинам, а также к некоторым нейрогормонам.

Оказалось, что центрофеноксин снижает содержание в нейронах мозга морских свинок липофусцина («пигмента старения») и оказывает омолаживающий эффект на нервную систему лабораторных животных и человека (Nandy, 1968). Не исключено, что это действие в значительной степени сводится к активации генома нейронов.

Управление активностью генома клетки как средство поддержания полноценного обновления протоплазмы во все возрасты, несомненно, имеет чрезвычайно важное значение. В этом направлении возможно представить ряд достаточно обоснованных экспериментальных подходов. За последние годы большое значение в активации процессов репродукции и трансляции в хроматине клеток придается особым белковым факторам, дестабилизирующим вторичную структуру ДНК, иначе говоря, «расплетающим» двойную спираль ДНК в хроматине (Lee, Dahmus, 1973- Дымшиц, Фет, 1977).

Близким к этому действием обладает на ДНК печени высших позвоночных синтез соматотропного гормона (СТГ) (Галавина, 1977). Представляется весьма перспективным использовать эти факторы в определенные периоды онтогенеза для геротерапии. Представляется несомненным, что клетка (в частности ее цитозоль) располагает гораздо большим набором специфических факторов (ферменты, компоненты белоксинтезирующего аппарата клеток, особые активирующие геном белки и т. д.), концентрация которых ослабляется с возрастом.

В этом отношении проведены исследования Биэлка и соавт. (Bielka, Junghan, 1974- Bielka et al., 1976) по возрастному падению активирующих трансляцию белков на рибосомах в цитозоле при старении. Клетки располагают и более простыми по молекулярной структуре факторами регуляции активности генома и белоксинтезирующего аппарата клетки.

Одним из них может быть система полиаминов (Caderera et al., 1976). Обладая отрицательным зарядом, они могут быть эффективными дерепрессорами, связывающими положительные заряды гистонов — не только структурными, но и репрессирующими факторами генома (см. обзор: Elgin, Weintraub, 1975). Клейнсмит и Стейн (Kleinsmith, Stein, 1976) выявили особое активирующее действие на транскрипцию гистоновых генов хромосомальными фосфолипидами.

Это — еще одно из направлений исканий регулирующих факторов активности генома клетки. Карион клетки располагает и другими путями управления активностью и характером функционирования генома, изменяющимися с возрастом.

Именно в онтогенезе происходят изменения не только в макромолекулярном составе хроматина, соотношении в нем ДНК и различных фракций гистоновых и особенно негистоновых белков и фосфолипидов (Мартыненко и др., 1972- Никитин и др., 1976б- Бердышев, Желябовская, 1972- Клименко, 1974, 1975- Клименко и др., 1975, 1976), но и в метилировании, ацетилировании и фосфорилировании различных фракций белков хроматина.

Как сдвиги в макромолекулярном составе генома, так и связывание белковых фракций (а также ДНК) хроматина с ацетильными, метальными и фосфатными группами могут оказывать и несомненно оказывают специфическое действие на процессы синтеза нуклеиновых кислот (Георгиев, 1973) и белков в клетке (Elgin, Weintraub, 1975- Rubin, Rosen, 1975- Romberg, 1977- Ванюшин, Бердышев, 1977).

В частности, предполагаются репрессирующее влияние ряда фракций гистонов и дерепрессирующее влияние фосфолипидов в хроматиновом комплексе генома. Пока что имеется лишь очень немного исследований с попытками влиять на геном клетки избирательным воздействием изолированных фракций белков хроматина и стимуляцией процессов метилирования и ацетилирования ДНК и белков генома клетки (см. сводки: Elgin, Weintraub, 1975- Клименко, 1975- Никитин, 1975- Ванюшин, Бердышев, 1977).

Почти отсутствуют попытки экспериментального воздействия на геном клетки фосфолипидами хроматина и «обслуживающими» геном клетки ферментными системами. Наконец, практически еще очень мало известно о факторах, могущих специфически воздействовать на макромолекулярные сдвиги в составе генома и на обмениваемость и активацию его компонентов в возрастном аспекте.

Третий путь воздействий на геном клеток — это защита его от возможного избыточного разрушения («изнашивания») при процессах нуклео- и протеосинтеза. Именно такой подход был применен Фролькисом (1976) при использовании инъекций оливомицина как геропротектора у лабораторных животных (белых крыс).

Оливомицин вводился внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг массы тела в 2 мл физиологического раствора ежедневно в течение 1.5 лет, курсами по 10 дней, с перерывами в 1 мес. Оказалось, что инъекции оливомицина увеличивали продолжительность жизни подопытной группы животных на 15.4% (СПЖ в контрольной группе — 30.85 мес, в опытной — 35.62 мес). Ингибиторы биосинтеза белка предупреждали развитие экспериментального атеросклероза у старых кроликов (Фролькис, 1976).

Генная инженерия старости

Потенциальные возможности применения генной инженерии в геротерапии чрезвычайно велики и многообещающи. Представляется весьма заманчивым заменять в стареющем, несущем на себе «печать возраста» геноме клетки места искажений первичной структуры ДНК, ведущие к нарушению процессов нуклео- и протеосинтеза в клетке и отсюда к пессимизации жизнедеятельности организма.

При этом с самого начала следует иметь в виду, что задачей генной инженерии может быть не примитивное удаление какого-то одного, «ответственного за старение» клетки гена. Такого одиночного гена, ответственного за развитие процессов старения, в геноме клетки нельзя себе представить.

Исключением является предположение Кошланда (Koshland, 1964) о гормоне смерти и соответственно гене, запускающем в позднем онтогенезе продукцию этого гормона, не нашедшее поддержки в современной геронтологии. Как подчеркивал уже давно Нагорный (1940), при старении в геноме клетки развиваются множественные изменения, в той или иной степени охватывающие все проявления жизнедеятельности.

Именно эта чрезвычайная сложность и комплексность возрастных изменений генома клетки определяет исключительную трудность гармоничного, строго адекватного, сложнейшего воздействия, необходимого для восстановления структурной и функциональной полноценности генома стареющей клетки. Естественно, это не исключает попыток избирательного введения групп генов, репарирующих поврежденные гены в период старости.

Генная инженерия в геронтологии имеет перед собой еще одну задачу. Процессы старения включают в себя не только просто «ухудшение» генома клетки, но и сложнейшие его приспособительные изменения (Фролькис, 1970, 1975, 1976). Поэтому возможно представить себе и такие поиски воздействий на геном клетки, которые включали бы «внедрение» в него новых, специальных «приспособительных» компенсаторных цистронов.

Наконец, вполне возможно допустить искание путей синтеза и внедрения в стареющий геном человека таких, ранее в нем не имевшихся генов, которые бы повышали, особенно в период старости, «запас функциональной прочности» организма.