Тест генерации тромбина

Этот методический подход был предложен британскими исследователями в 1953 г. для оценки состояния системы гемостаза при гемофилии. Следует, однако, отметить, что предложенная методика в оригинале была весьма далека от совершенства, поэтому длительное время ей не уделялось серьезного внимания. Второе рождение метод пережил благодаря Конраду Хемкеру, внесшему многочисленные усовершенствования в процедуру анализа в 90-е годы прошлого века. Важнейшей модификацией К. Хемкера и соавт. явилось использование флюоро- и хромогенного субстратов для детекции генерации тромбина, что существенно повысило воспроизводимость метода. В современном варианте метода тромбин, образующийся в ходе реакции, разрушает пептидный субстрат, что обусловливает высвобождение молекулы флюорофора. Изменение интенсивности свечения регистрируется флюориметром через равные промежутки времени.

Принцип метода

В основе теста лежит учет скорости гидролиза пептидной связи флюорогенного субстрата, специфичного к тромбину. Определение скорости разрушения субстрата осуществляется флюориметром в лунках 96-луночного планшета, в которых инкубируют смесь образца БТП с активатором коагуляции. В качестве активатора используют реагент рекомбинантного тканевого фактора и кальция хлорид, а для стандартизации и повышения скорости коагуляции в тест-систему добавляют фосфолипиды. Изучение кинетики образования тромбина позволяет оценить баланс прокоагулянтных и антикоагулянтных механизмов.

Реактивы и оборудование

• Рекомбинантный человеческий тканевой фактор (1 пмоль).
• Специфичный к тромбину флюорогенный субстрат.
• Буферный раствор, содержащий кальция хлорид.
• Калибратор с активностью человеческого тромбина 580 нмоль.
• Флюориметр.

Образцы крови для исследования

В качестве образца для записи тромбоэластограммы следует использовать БТП. В ряде исследований для учета вклада тромбоцитов в генерацию тромбина предлагают использовать богатую тромбоцитами плазму. Тест весьма чувствителен к дефектам и особенностям преаналитического этапа исследования.

Видео: lecture 29 - Test Generation Methods

Техника выполнения

Процедура исследования проводится в соответствии с инструкцией к используемому оборудованию и алгоритмом компьютерной программы, вычисляющей основные показатели динамики генерации тромбина.

Оценка результатов исследования

Флюорогенный субстрат специфичен к тромбину, поэтому изменение интенсивности свечения после добавления активатора коагуляции пропорционально скорости генерации этого ключевого коагулирующего фермента.

После выполнения калибровки стандартным количеством тромбина флюориметр позволяет построить кривую генерации тромбина. В процессе исследования оценивают время задержки образования тромбина (Lag time), максимальное количество тромбина (Peak thrombin), время достижения максимального образования тромбина (ttPeak), а также эндогенный тромбиновый потенциал (ЕТР).

Интерпретация результатов исследования

Поскольку коагуляционный фактор На служит ключевым ферментом коагуляционного гемостаза, тест генерации тромбина представляется ценным интегральным показателем состояния системы свертывания крови.

Результаты теста зависят от способа активации коагуляции, концентрации активатора и многих других факторов, поэтому изменение условий методики позволяет адаптировать ее для выявления различных дефектов системы гемостаза. Так, добавление в тест-систему тромбомодулина помогает определить гиперкоагуляционные сдвиги на фоне лейденовской мутации. Изучение генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме дает возможность обнаружить дисфункцию тромбоцитарного гемостаза при тромбастении Гланцмана, синдроме Бернара—Сулье и др.

Наиболее часто используют активацию свертывания БТП тканевым фактором, что позволяет оценить состояние коагуляционного гемостаза. В таком исполнении у больных гемофилией и другими коагулопатиями показатель Lag time удлинен, а ЕТР и Peak thrombin снижены. Выраженность указанных изменений у таких больных зависит от активности коагуляционных факторов VIII и IX.

Причины ошибок

Ошибки преаналитического этапа исследования, в т. ч. неправильная дозировка цитрата при заборе венозной крови.

• Дефекты центрифугирования при получении образцов БТП.
• Попадание в исследуемую кровь гепарина из венозного катетера.
• Гемолиз.

Другие аналитические технологии

В настоящее время разработаны другие аналитические технологии, способные визуализировать коагуляционный процесс, например метод регистрации пространственного роста сгустка крови, а также тромбоэластография. Все подобные методики визуализируют свертывание крови и способны вычислить интегральные показатели коагуляции, но их диагностическая специфичность пока остается низкой.