Методы лабораторной диагностики. Иммунологические методы

Видео: CMD - Центр молекулярной диагностики

Иммунологические методы исследования имеют важное диагностическое и прогностическое значение при многих ревматических заболеваниях.

Изучение неспецифического иммунитета включает в себя исследование количества лейкоцитов и моноцитов в сыворотке крови, компонентов комплемента, оценку подвижности, фагоцитарной и микробицидной активности мононуклеарных фагоцитов, выработку ими провоспалительных цитокинов (ИЛ-ip, ИЛ-6, ФНО-а и др.).

Увеличение уровня комплемента наблюдается при остром воспалении, инфекционных процессах, а уменьшение — при иммунокомплексных заболеваниях. Так, уменьшение концентрации С2- и Сз-компонентов комплемента в реакции преципитации с антисыворотками характерно для СКВ, РА, болезни Бехтерева, васкулитов, неспецифического язвенного колита. Это связано с активацией системы комплемента вследствие образования иммунных комплексов. Диагностически значимо определение компонентов комплемента в синовиальной жидкости (содержание снижается при РА), в спинномозговой жидкости (содержание снижается при волчаночном цереб-роваскулите), в биоптатах кожи и почек.

Состояние клеточного иммунитета оценивается количественными показателями (абсолютное и процентное содержание Т-лимфоцитов, активных Т-лимфоцитов, Т-хелперов I типа и Т-цитотоксических лимфоцитов) и функциональными тестами.

Наиболее часто используют:
&diams- реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в присутствии антигенов и митогенов: РТМЛ с фитогемагглютинином (ФГА), конканавалином А (КОН-А), аллергенами гемолитического стрептококка, стафилококка. В основе реакции лежит свойство лимфоцитов при сенсибилизации организма к определенным антигенам образовывать стабилизирующие лимфокины, тормозящие миграцию лейкоцитов- чем выше функциональная активность лимфоцитов, тем меньше показатели РТМЛ;
&diams- реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), с помощью которой оценивают функциональную активность Т-лимфоцитов. В ответ на действие митогенов (ФГА), КОН-А, антилимфоцитарной сыворотки и др. происходит трансформация лимфоцитов в лимфобласты (чем больше образуется бластных клеток, тем выше активность Т-лимфоцитов).
Субпопуляции Т-лимфоцитов определяют с помощью моноклональных антител.

Для оценки функционального состояния гуморального иммунитета используется количественное определение иммуноглобулинов в плазме крови. Иммуноглобулины (Ig) — это белки, обладающие функцией антител и подразделяющиеся на 5 основных классов: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.

IgG присутствует в сыворотке крови в наиболее высокой концентрации (6,39—13,49 г/л), на его долю приходится 80% антительной активности. Различают 4 субкласса IgG: IgG2 (60-70%), IgG2 (20-30%), IgG3 (5-8%) и IgG4 (1-3%).

IgA является основным секреторным иммуноглобулином, обнаруживается в слюне, слезах, кишечных и бронхиальных секретах и материнском молоке. В секретах IgA находится в виде димера, содержащего J-цепь и еще один пептид, называющийся секреторным компонентом. Концентрация IgA в норме составляет 0,7—3,12 г/л.

IgM состоит из 5 мономерных субъединиц, связанных дисульфидными мостиками и J-цепью, образующих пентамер. Концентрация IgM в сыворотке крови в норме составляет 0,86—3,52 г/л.

IgD находится в сыворотке в следовых количествах, но является основным типом иммуноглобулинов, присутствующих на мембране В-лимфоцитов. IgE играет важную роль в реакциях гиперчувствительности немедленного типа.

Для определения концентрации иммуноглобулинов основных классов (IgG, IgM, IgA) используют метод радиальной иммунодиффузии или нефелометрическую технику, IgE — высокочувствительные радиоиммунологический или иммуноферментный методы.

Определение концентрации иммуноглобулинов используют для диагностики первичных или вторичных иммунодефицитов (в этих случаях наблюдается снижение концентрации иммуноглобулинов основных классов), а также моноклональных иммуноглобулинопатий (в сочетании с иммуноэлектрофорезом сыворотки и мочи).

Наиболее частой формой иммунодефицитов является IgA-иммунодефи-цит, развитие которого иногда наблюдается при ревматических заболеваниях, а также может иметь место на фоне приема некоторых лекарственных препаратов (D-пеницилламина, сульфасалазина, каптоприла и др.). Увеличение концентрации IgA нередко наблюдается при серонегативных спондилоартропатиях, геморрагическом васкулите, болезни Шегрена, псориатической артропатии.

Часто при воспалительных ревматических заболеваниях наблюдается развитие поликлональной гипериммуноглобулинемии.
Ревматоидные факторы (РФ) являются аутоантителами к Fc-фрагменту IgG, хотя они могут быть связаны и с IgM и IgA.

Возможно блокирование ревматоидного фактора аутологичным IgG, что ведет к увеличению процента скрытых, комплексированных РФ (при длительном течении ревматоидного артрита с висцеритами).

Для выявления РФ класса М применяются:
&diams- реакция латекс-агглютинации с инертными частицами латекса, покрытыми человеческим Ig. Наибольшее разведение сыворотки, дающее агглютинацию, считается титром реакции. Титр 1:20 и выше расценивается как положительный;


&diams- реакция Ваалера—Розе с бараньими эритроцитами, сенсибилизированными кроличьими антителами против эритроцитов барана.

Наибольшее разведение сыворотки, дающее агглютинацию, диагностически значимо, если составляет не менее 1:32.
Волчаночные (LЕ)-клетки. Наличие LE-клеток обусловлено присутствием в сыворотках антител класса IgG к ДНК-гистоновому комплексу, которые реагируют с ядрами, высвобождающимися из различных клеток в результате разрушения этих клеток. LE-клетки обнаруживаются в 60—70% случаев у больных СКВ. Они представляют собой зрелые нейтрофилы, фагоцитировавшие ядерную субстанцию разрушенных клеток. В цитоплазме нейтрофилов обнаруживаются крупные гомогенные включения (гематоксилиновые тельца).

В случаях незавершенного фагоцитоза нейтрофилы скапливаются вокруг гематоксилинового тельца в форме розетки (феномен розеткообразования). Результат выявления не менее 5 LE-клеток на 1000 лейкоцитов считается положительным. В единичном количестве LE-клетки обнаруживаются у 10% больных РА, при хроническом активном гепатите, лекарственной аллергии, узелковом периартериите, системной склеродермии, дерматомиозите, смешанном заболевании соединительной ткани.

Антинуклеарные антитела (AHA) наиболее часто определяются при ревматических заболеваниях и встречаются более чем у 90% больных СЗСТ. Они представляют собой семейство аутоантител, взаимодействующих с рибонуклеиновыми кислотами и белками ядра, цитоплазматическими антигенами. Определяют AHA методом непрямой иммунофлюоресценции, двойной иммунодиффузии и контрэлектрофореза, иммуноферментным методом и методом иммуноблоттинга.

При использовании метода непрямой иммунофлюоресценции в практической работе выделяют шесть типов окрашивания, или свечения, ядра, которые важны для диагностики системных заболеваний соединительной ткани:
&diams- гомогенное окрашивание, связанное с наличием антител к двуспиральной ДНК и гистонам, наиболее характерно для СКВ и лекарственной волчанки;
&diams- периферическое окрашивание, вызванное циркуляцией антител к ядерной мембране (специфично для СКВ);
&diams- гранулярное окрашивание встречается наиболее часто, указывает на наличие различных AHA, поэтому обладает наименьшей специфичностью (отмечается при СКВ, РА с висцеральными проявлениями, смешанном заболевании соединительной ткани);
&diams- нуклеолярное (ядрышковое) свечение обусловлено антителообразованием к компонентам ядрышка, встречается при ССД, болезни Шегрена- изредка АНФ обнаруживаются при эндокринных заболеваниях (полиэндокринопатия, сахарный диабет I типа, тиреоидит, тиреотоксикоз), кожных заболеваниях (псориаз, пузырчатка), а также на фоне беременности, после трансплантации органов и тканей (при развитии реакции «трансплантат против хозяина»), у больных, находящихся на программном гемодиализе;
&diams- центромерное свечение отмечается при появлении антител к центромерам хромосом (характерно для хронического течения ССД);
&diams- цитоплазматическое свечение указывает на наличие антител к тРНК-синтетазам, в частности Jo-1 (встречается при дермато- и полимиозите).



Методами радиоактивного и иммунного связывания, радиальной иммунодиффузии, иммунопреципитации выявляются AHA к отдельным ядерным антигенам.

Антитела к дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК). Антитела к нативной (двуспиральной) ДНК, особенно те из них, которые выявляются с помощью радиоиммунного теста (метод Фарра), относительно специфичны для СКВ. Их определение имеет существенное значение для оценки активности болезни, прогнозирования развития обострений и эффективности проводимой терапии. Антитела к денатурированной (односпиральной) ДНК менее специфичны для СКВ и часто выявляются при других ревматических заболеваниях.

Антитела к гистонам. Гистоны — это компоненты ядра, состоящие из трех субъединиц: двух димеров Н2А—Н2В, которые фланкированы тетрамером НЗ—Н4 и ассоциированы с третьей субъединицей, состоящей из двух витков молекулы ДНК.

Антитела к гистонам Н2А—Н2В обнаруживаются почти у всех больных с медикаментозным волчаночноподобным синдромом (индуцированным новокаинамидом), у больных, получающих новокаинамид, но не имеющих симптомов волчанки, а также у 20% больных СКВ.

Антитела к рибонуклеопротеинам (РНП). Антитела к рибонуклеопротеинам, включающие анти-Sm, анти-snRNP (U1RNP), анти-Ro/SS-A, анти-La/SS-B, суммарно встречаются при СКВ чаще, чем антитела к двуспиральной ДНК. Концентрация этих антител в крови необычайно высока. Обнаруживаются при смешанном заболевании соединительной ткани, реже — у больных СКВ, у которых ведущим клиническим проявлением является поражение кожи, подостром течении ССД и других аутоиммунных ревматических заболеваниях.

Антитела к Sm(Smith)-антигену. Антитела к Sm-антигену обнаруживаются только при СКВ. С помощью иммунофлюоресцентного метода они выявляются в 30% случаев, и в 20% — по данным метода гемагглютинации. Антитела к Sm-антигену не выявляются при других ревматических заболеваниях, поэтому они рассматриваются как антитела-маркеры СКВ и их выявление входит в число диагностических критериев этого заболевания. При наличии Sm-антител наблюдается более злокачественное течение заболевания, поражение центральной нервной системы, волчаночные психозы и относительная сохранность функции почек. Однако уровень антител к Sm-антигену не коррелирует с активностью и клиническими субтипами СКВ.

Антитела к Ro(Robert)/SS-A направлены против ядерных рибонуклеопротеинов, с которыми связаны Yl—Y5 цитоплазматические РНК, транскрибируемые РНК-полимеразой III. В зависимости от чувствительности используемых методов исследования антитела к Ro/SS-A обнаруживаются у 60-78% больных с синдромом Шегрена, у 96% больных болезнью Шегрена и у 35-57% больных СКВ.

При СКВ продукция данных антител ассоциируется с определенным набором клинических проявлений и лабораторных нарушений: фотосенсибилизацией, синдромом Шегрена, поражением легких, лимфопенией, тромбоцитопенией и гиперпродукцией РФ. Повышение концентрации антител к Ro/SS-A в сочетании с гиперпродукцией IgM РФ часто наблюдается при АНФ-отрицательном подтипе заболевания (у 2-5% больных СКВ) — так называемой подострой кожной волчанке.

Антитела к La(Lane)/SS-B направлены против белков, связанных с транскриптами РНК-полимеразы III. Антитела к La/SS-B в большинстве случаев наблюдаются совместно с антителами к Ro/SS-A, в то время как последние могут встречаться изолированно. Антитела к La/SS-B обнаруживаются при болезни и синдроме Шегрена, сочетающемся с РА и СКВ (но не с системной склеродермией), и при первичном билиарном циррозе печени. При СКВ антитела к SS-B/La-антигену чаще встречаются в начале болезни, развивающейся в пожилом возрасте, и ассоциируются с низкой частотой развития нефрита.

Антитела Scl-70 чаще выявляются при диффузной форме системной склеродермии. При данном заболевании присутствие антител Scl-70 в сочетании с носительством генов HLA-DR3/DRw52 в 17 раз увеличивает риск развития легочного фиброза. Обнаружение антител Scl-70 у больных с изолированным феноменом Рейно указывает на высокую вероятность развития системной склеродермии.

Антицентромерные антитела (АсА) обнаруживаются у 20% больных системной склеродермией (у большинства из них имеются признаки CREST-синдрома), реже — при первичном билиарном циррозе печени (у половины этих больных имеются признаки склеродермии) и очень редко — при хроническом активном гепатите и первичной легочной гипертензии. Антитела к центромере рассматриваются как прогностически неблагоприятный показатель развития системной склеродермии у больных с синдромом Рейно.

Антитела к аминоацилсинтетазе тРНК (антисинтетазные антитела) обнаруживаются при наличии у больных полимиозитом интерстициального поражения легких. В целом антитела к синтетазам выявляются у 40% больных с полимиозитом, у 54% больных с дерматомиозитом в случае идиопатической формы этих заболеваний и только у 6% больных полимиозитом, являющимся одним из проявлений других ДБСТ- при опухолевом миозите эти антитела не обнаруживаются. Продукция антисинтетазных антител ассоциируется с развитием так называемого «антисинтетазного синдрома».

Антифилаггриновые антитела (АФА) представляют семейство, в которое входят антикератиновые антитела, антиперинуклеарный фактор, антитела к Sa-антигену и недавно описанные антитела к циклическому цитруллин-содержащему пептиду. По современным представлениям, главной антигенной детерминантой, распознаваемой этими антителами, является цитруллинированные пептиды, которые, в частности, присутствуют в синовиальной оболочке больных ревматоидным артритом (РА). АФА являются высокоспецифическими для РА. Наибольшее применение АФА находят в диагностике раннего РА. В ряде работ показано более агрессивное течение РА при наличии у больных этих антител.

Антитела к фосфолипидам (АФЛ) — гетерогенная группа аутоантител, реагирующих с отрицательно заряженными (фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, кардиолипин) и нейтральными (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин) фосфолипидами. К ним относятся волчаночный антикоагулянт, антитела к кардиолипину и факторы, которые определяют развитие ложноположительной реакции Вассермана.

Волчаночный антикоагулянт (ВА) — иммуноглобулины классов IgG и/или IgM, подавляющие in vitro одну или несколько фосфолипидзависимых коагуляционных реакций, ВА рассматривают как представитель семейства антител к фосфолипидам, их синтез ассоциируется с развитием венозных или артериальных тромбозов.

Антитела к кардиолипину (АКЛ). Для определения АКЛ используют иммуноферментный метод. Продукция АКЛ (особенно при высоких титрах АКЛ класса IgG), так же как и образование ВА, ассоциируется с развитием антифосфолипидного синдрома.

Ложноположительная реакция Вассермана является быстрым серологическим методом диагностики сифилиса, основанным на флоккуляции стандартной суспензии фосфолипидов (кардиолипин) сывороткой больного, содержащего антитрепонемные антитела (реагин). Для более точной диагностики сифилиса используют метод иммунофлюоресценции с трепонемным антигеном.

У 15-20% больных СКВ выявляется ложноположительная реакция Вассермана, а у 30% здоровых лиц с ложноположительной реакцией Вассермана в последующем развивается СКВ. Особенно часто ложноположительная реакция Вассермана обнаруживается у больных с антифосфолипидным синдромом.

Антинейтрофильные цитоплазматинеские антитела (АНЦА). АНЦА относятся к семейству аутоантител, направленных против специфических антигенов, присутствующих в цитоплазме нейтрофилов. Существует два типа АНЦА, которые определяют с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции при использовании фиксированных абсолютным спиртом нейтрофилов доноров. Антитела к протеиназе III вызывают диффузное (классическое) цитоплазматическое свечение и обозначаются как к-АНЦА или ц-АНЦА. Антитела к миелопероксидазе, эластазе и лактоферрину характеризуются перинуклеарным типом свечения и обозначаются как перинуклеарные или п-АНЦА. АНЦА часто выявляются при системных васкулитах.

Стрептококковая инфекция вызывает увеличение титров антистрептококковых антител. Определение антистрептококковых антител используют для диагностики острого ревматизма (острой ревматической лихорадки) и острого гломерулонефрита.

Наибольшее распространение получило определение антител к стрептолизину О (АСЛ-О), стрептокиназе (АСК) и стрептодезоксирибонуклеазе В (анти-ДНКаза В). Увеличение титров АСЛ-О обнаруживается более чем у 2/3 больных с острой ревматической лихорадкой и только у половины больных острым гломерулонефритом. Максимальные титры антистрептококковых антител выявляются в период развития полиартрита, а во время развития кардита или хореи титры этих антител значительно уменьшаются, что снижает диагностическую ценность данного теста.

Важное значение для диагностики имеют реакции определения антител после перенесенных инфекций: реакция Вассермана, реакции связывания комплемента с туберкулезным, псевдотуберкулезным, иерсиниозным, шигеллезным и другими антигенами, HBs-антигенами, гонококковым (реакция Борде-Жангу) и бруцеллезным (реакция Райта—Хеддльсона) антигенами, титр антихламидийных антител.

Криоглобулины — группа сывороточных белков, обладающих аномальной способностью к обратимой преципитации или образованию геля при низкой температуре. Криоглобулины могут обнаруживаться при различных заболеваниях внутренних органов, в том числе весьма часто при системных ревматических болезнях.

В зависимости от состава криоглобулины разделяют на три основных типа. Тип I состоит из моноклональных иммуноглобулинов IgA или IgM, реже — моноклональных легких цепей (белок Бенс-Джонса). Тип II (наблюдается при так называемой смешанной криоглобулинемии) состоит из моноклональных иммуноглобулинов (обычно IgM, реже — IgA или IgG), обладающих антиглобулиновой активностью против поликлонального IgG. Тип III (наблюдается при так называемой смешанной криоглобулинемии) состоит из одного или нескольких классов поликлональных иммуноглобулинов. Самой частой формой криоглобулинемии при ревматических заболеваниях является тип III Он встречается при СКВ, РА, системной склеродермии, синдроме Шегрена.

Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Увеличение концентрации ЦИК отражает воспалительную и иммунологическую активность патологического процесса при СКВ, РА, серонегативных спондилоартропатиях.

В.И. Мазуров