Терапия-влияние генов,отвечающих за синтез кардиальных белков актина и дистрофина,на развитие хронической сердечной недостаточности у больных с инфарктом миокардаи дилатационной кардиомиопатией

Для понимания механизмов развития и прогрессирования хроническойсердечной недостаточности (ХСН) научные исследования последнихлет сосредоточиваются на оценке вклада генетических факторов вразвитие недостаточности кровообращения. Это является перспективнымподходом в связи с тем, что выявляется генетический риск и происходитпрогнозирование осложнений заболевания до появления их клиническихпроявлений [1, 2]. Так, в настоящее время на молекулярном уровнерассматривается патогенез кардиомиопатий, поскольку происходитнарушение в процессе экспрессии генов, в частности механизмовпретрансляции, трансляции и посттрансляции, что ведет к изменениюфенотипа [2]. Известны работы по выявлению генетических факторовразвития ХСН у больных с дилатационной кардиомиопатией (ДКМП),в частности у этих больных выявлялись мутации в различных участкахгенов, отвечающих за синтез белков дистрофина и актина [3, 4,5, 6].
В литературе отсутствуют сообщения о мутациигена дистрофина и актина у больных с инфарктом миокарда, хотяможно предположить, что аналогичная мутация возможна под влияниемстресса и активации нейрогуморальных механизмов.
В связи с этим целью работы явилось исследованиегенов актина и дистрофина и у больных с идиопатической ДКМП, иу лиц, перенесших инфаркт миокарда.

Материалы и методы

В исследованиевключено 130 больных, из них 104 мужчин и 26 женщин, в возрастеот 21 до 88 лет. Больные были разделены на три группы: 1-я группа- больные острым крупноочаговым и трансмуральным инфарктом миокарда,осложнены ХСН II - IV ФК по NYHA, 2-я группа - с инфарктом миокардабез клинических признаков сердечной недостаточности, 3-я группа- больные идиопатической ДКМП с ХСН II - IV ФК. Группу контролясоставило 30 человек, из них 21 мужчин и 9 женщин, в возрастеот 25 до 76 лет (средний возраст 55,5 лет) без сердечно-сосудистойпатологии и не имеющих тяжелых хронических заболеваний.
Клинико-демографическая характеристика больныхпредставлена в таблице.
Исследование генов актина и дистрофина производилосьв Институте общей генетики, в лаборатории экологической и радиационнойгенетики Института биологии гена РАН.
Для выделения ДНК была использована цельнаякровь, взятая в пробирку с ЕДТА с конечной концентрацией 50mMили цитратом с конечной концентрацией 0,5%. Выделение ДНК проводилис использованием набора реагентов “DiatomTMDNA Prep 200”(фирма “Biokom”). В основе выделения ДНК с помощью данного наборалежит использование лизирующего реагента с гуанидинтиоционатоми сорбента ДНК “Nucleos”. В присутствии высоких концентраций гуанидинтиоционата(4M) ДНК активно сорбируется на поверхности частичек “Nucleos”,а остальные компоненты крови остаются в среде, которые затем удаляютсяцентрифугированием. ДНК, промытая спиртосолевым буфером, затемсмывается с сорбента ЭкстраГеном, смесью ионообменников и напрямуюиспользуется для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР).Выделения ДНК из цельной крови проведены в соответствии с инструкциейиспользованного набора “DiatomTMDNA Prep 200” фирмы “Biokom”.
Для обнаружения мутации в гене кардиоактинаиспользовали метод PCR-RFLP, согласно которому продукт ПЦР режетсясоответствующей рестриктазой, узнающей интересующую точечную нуклеотиднуюзамену. Рестриктаза Bcl I с сайтом рестрикции (-TGATCA-) выявляетмиссенс мутацию G (норма) на А (мутация) в 5-лс экзоне гена кардиоактина,связанная с идиопатической дилатационной кардиомиопатией. Синтезпраймеров для исследования 5-м экзона кардиоактина был проведенна синтезаторе PE Applied Biosystems (США). Состав праймеров:F 5/-gactcgttcccaggtatg R 5/-gatctcccactcacaaaag.
Постановку ПЦР проводили в следующем режимеамплификации: 950С - 40 с, 580С - 30 с, 740С - 40 с по 30 циклов.
Размер амплифицированного фрагмента 222 парынуклеотидов. Конечные концентрации реакционной смеси ПЦР: 67 mMТрис Hcl c pH = 8,8, 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 ед. Taq.полимеразы, 200mM dNTP каждого,0,5 mM праймеров каждого 10-20ng ДНК исследуемой, 1,5 mM MgCl₂,конечный объем PCR смеси 30 мкл.
Для анализа результатов амплификации 10 мклПЦР продукта наносили на 2% агарозный гель-электрофорез. ДНК вгеле проявляли с бромистым этидием в УФ-свете длиной волны 32нм. После визуальной оценки концентрации PCR продукта определялиобъем PCR смеси, необходимой для постановки реакции рестрикции(от 5 до 10 мкл PCR смеси).

Исследование гена дистрофина

Для обнаружениямутации в гене дистрофина использовали метод ПЦР с сиквенсспецифическимипраймерами (PCR-SSP), согласно которому для проведения ПЦР используетсяпара праймеров, один из которых содержит одну или две точечныезамены. Одна из замен представляет собой интересующую точечнуюнуклеотидную замену. Принцип метода заключается в том, что приоптимальной температуре отжигаются праймеры при отсутствии мутациии появляется специфическая полоса ПЦР продукта, а в случае мутациипри той же температуре праймеры не отжигаются и реакция амплификациине проходит. Выбранные две пары сиквенсспецифических праймеровпредназначены для обнаружения миссенс мутации A на G в 9-м экзонегена дистрофина нормальной последовательности и с мутацией, соответственносвязанная с Х-сцепленной идиопатической ДКМП.
Синтез праймеров для исследования 5-го экзонакардиоактина был проведен на синтезаторе PE Applied Biosystems(США).
Состав праймеров: Dn 5-gta aat gtt gac aga cctgtg 5-gaa cct ctc tcg cag atc acg Dm 5-gta aat gtt gac aga cctgtg 5-gga tcc tct ctc gca gat cgc a
Постановку ПЦР проводили в следующем режимеамплификации: 950С - 40 с, 560С - 30 с, 740С - 40 с по 35 циклов.
Размер амплифицированного фрагмента 160 парнуклеотидов. Конечные концентрации реакционной смеси ПЦР: 67 mMТрис Hcl c pH = 8,8- 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 ед. Taq полимеразы, 200mM dNTP каждого,0,5 mM праймеров каждого 10-20ng ДНК исследуемой, 1,5 mM MgCl₂,конечный объем ПЦР смеси 30 мкл.
Таблица. Клинико-демографическая характеристика больных.

Для анализа результатовамплификации 10 мкл ПЦР продукта наносили на 2,5% агарозный гель-электрофорез.ДНК в геле проявляли с бромистым этидием в УФ-свете длиной волны320 нм.
Для выявления точковой мутации в исследуемыхпробах регистрируют наличие или отсутствие амплифицированногофрагмента с соответствующей парой праймеров:
1. Наличие ПЦР фрагмента длиной в 160 пар нуклеотидовпри амплификации с парой праймеров для нормальной последовательностиуказывает на норму.
2. Отсутствие ПЦР фрагмента длиной в 160 парнуклеотидов при амплификации с парой праймеров для нормальнойпоследовательности указывает на наличие предполагаемой мутации.
3. Наличие ПЦР фрагмента длиной в 160 пар нуклеотидовпри амплификации с парой праймеров для последовательности с мутациейподтверждает наличие мутации.

Результаты и их обсуждение

Как указывалось,в литературе отсутствуют сообщения о мутации гена дистрофина иактина у больных с ишемической болезнью сердца, в частности синфарктом миокарда, хотя под влиянием нейрогормонов и других биологическиактивных веществ, которые активизируются в ответ на повреждениесердечной мышцы (в данном случае при инфаркте миокарда), возможнопредположить аналогичную мутацию. Однако, несмотря на правильныетеоретические предпосылки и наши ожидания, мутации этих генову исследуемых больных выявлено не было. Более того, не определяласьмутация и в группе больных с ДКМП, хотя в последние годы в результатеряда исследований получены достаточно значимые результаты, которыекасаются связи мутации генов дистрофина и актина с сердечной недостаточностью.В частности, R. Ortiz-Lopez и соавт. [2] исследовали геномнуюДНК в 3 неродственных семьях с Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатией.Группа контроля включала 50 лиц женского и 50 мужского пола, неявляющихся родственниками. Для амплификации ДНК использовали ПЦР.В результате исследования в одной из семей с Х-сцепленной ДКМПбыла выявлена мутация гена, кодирующего дистрофин, локализующегосяв 21-й хромосоме, в частности найдена замена аденина на гуанинв экзоне 9 в позиции 1043, что привело к синтезу гидрофобной неполярнойаминокислоты аланина вместо гидрофильного полярного треонина,находящегося в дистрофине в позиции 279, относящейся кN-концу белка дистрофина. Замена треонина на аланин ведет к изменениюполярности N-конца белка и, следовательно, к изменению вторичнойи третичной структуры дистрофина. Таким образом, данная мутацияявляется причиной потери мембраностабилизирующей функции этогобелка и нарушения функциональной активности кардиомиоцита, чтои приводит к Х-сцепленному дегенеративному заболеванию миокарда- Х-сцепленной ДКМП.
F. Muntoni и соавт. [4], а также J. Milasinи соавт. [5] описывали мутации в других участках гена дистрофина.Эти участки были исследованы R. Ortiz-Lopes и соавт. [3] в техже 3 семьях с Х-сцепленной ДКМП, мутации в этих участках выявленоне было. Следовательно, можно думать о различных механизмах, ведущихк развитию дистрофинопатий.
Таким образом, любая мутация гена дистрофинаприводит к дефициту этого миокардиального белка, что являетсяпричиной отсутствия в миокарде дистрофинассоциированных гликопротеидов[7, 8], отвечающих за связывание мультипротеинного комплекса сбелками экстрацеллюлярного матрикса. Результатом этого являетсядезорганизация кардиомиоцитов, ведущая к изменению механическоймодели миокарда, нарушению его насосной функции и ХСН.
Что касается мутации кардиального актина, тов 1998 г. опубликована работа T. Оlson и соавт. [6], продемонстрировавшая исследование двух не родственных семейс аутосомно-доминантной идиопатической кардиомиопатией (одна семьянемецкого происхождения, вторая - шведско-норвежского). Для всехчленов проводились эхокардиографическое исследование, биопсиямиокарда, выявившая характерные для ДКМП признаки (фокальный интерстициальныйфиброз и гипертрофию кардиомиоцитов). Для обнаружения мутациив гене актина использовалась ПЦР. Выявлены две одиночные мутацииэтого гена: одна - в 5-м экзоне гена кардиоактина (замена гуанинана аденин, что приводит к кодированию синтеза гистидина в 312-мположении вместо аргинина), другая - в 6-м экзоне (замена аденинана гуанин, следствием чего явился синтез в 361-м положении глицинавместо глутамина). Но можно было бы эти замены рассматривать врамках полиморфизма гена кардиоактина. Для исключения такого предположенияпротестированы 435 неродственных людей, описанной мутации выявленоу них не было. Следовательно, указанные варианты гена актина ассоциируютсяименно с идиопатической ДКМП.
То, что в нашей работе не выявлялась мутациягенов актина и дистрофина, не является прямым утверждением того,что мутации действительно нет. Возможно, мутация происходит вболее поздние сроки заболевания? Следует отметить, что в нашемисследовании не проводилось генетического анализа в семьях с идиопатическойДКМП, а были взяты неродственные люди. Вероятно, для глубокихвыводов необходимо также большое в популяционном плане исследование.И, может, не менее значимым было бы исследование генов другихструктурных компонентов сердечной мышцы, в частности коллагенаи эластина, мутация которых, возможно, тоже имеет значение в развитииХСН.

Литература:
1. Tерещенко С. Н. Клинико-патогенетическиеи генетические аспекты хронической сердечной недостаточности ивозможности медикаментозной коррекции. / Дисс. … д-ра. мед. наук.- М. 1998- 287.
2. Bristow M.R. Why does the myocardium fail?Insights from basic science. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ortiz-Lopez R., Li H., Su J., Goytia V.,Towbin J.A. Evidence for a dystrophin missensemutation as a cause of X-linked dilated cardiomyopathy. //Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F., Cau M., Ganau A., Congiu R.,Arvedi G., Mateddu A., Marrosu M.G., Cianchetti C., Realdi G.,Cao A., Melis M.A. Brief report: deletion of the dystrophin muscle-promoterregion associated with X-linked dilated cardiomyopathy. // N.Engl. J. Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasin J., Muntoni F., Severini G.M., BartoloniL., Vatta M., Kraoinovic M., Mateddu A., Angelini C., CameriniF., Falaschi A., Mestroni L., Giacca M. and HMD Study Group. Apoint mutation in the 5` splice site of the dystrophin gene firstintron responsible for X-linked dilated cardiomyopathy.// Hum.Mol. Genet. 1996- 5: 73-9.
6. Olson T.M., Michels V.V., Thibodeau S.N.,Tai Y.S., Keating M.T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy,a heritable form of heart failure. // Science. 1998- 280: 750-2.
7. Bies R.D., Maeda M., Roberds S.L., HolderE., Bohlmeyer T., Young J.B., Campbell K.P. A 5` dystrophin duplicationmutation causes membrane deficiency of alpha-dystroglycan in afamily with X-linked cardiomyopathy. // J. Mol. Cell. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Franz W.M., Cremer M., Herrmann R., GrunigE., Fogel W., Scheffold T., Goebel H.H., Kircheisen R., KublerW., Voit T. et al. X-linked dilated cardiomyopathy. Novel mutationof the dystrophin gene. // Ann NY Acad. Sci. 1995- 752: 470-91.