Основные подходы к пренатальной диагностике генных болезней. Прямая диагностика генных аномалий.

Методы молекулярной диагностики — продукт и основной инструмент анализа первичной структуры, т.е. последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК — основы генома (наследственного аппарата) человека. Первый этап грандиозной Международной научной программы по расшифровке молекулярной структуры ДНК человека был завершен в 2000 г. созданием «чернового варианта генома человека». В настоящем разделе мы ограничимся изложением лишь основных принципов ДНК-методов. Более детально с техникой молекулярных исследований можно ознакомиться в специальных монографиях и руководствах.

Основу методов ДНК-диагностики, направленных на идентификацию мутаций или молекулярное маркирование мутантных хромосом, составляет полимеразная цепная реакция синтеза ДНК (ПЦР). Исторически более ранний метод блот-гибридизации по Саузерну в настоящее время применяется значительно реже, хотя и используется для идентификации некоторых мутаций, прежде всего динамических мутаций», ведущих к болезням экспансии (синдром ломкой Х-хромосомы, миотоническаядистрофия, хорея Гентингтона, ряд нейродегенеративных заболеваний), а также гемофилии А и некоторых других заболеваний.

Метод ПЦР предложен в 1983 г. американским исследователем Карри Муллисом, удостоенным за это открытие Нобелевской премии в 1993 г. Метод позволяет избирательно синтезировать (амплифицировать) in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.

Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигонуклеотидными последовательностями ДНК, обычно длиной от 15 до 30 п.о., комплементарными 3`-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК соответственно. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. Подробно с техникой постановки ПЦР можно ознакомиться в руководствах.

Метод ПЦР стал одним из основных в молекулярной диагностике наследственных болезней. Разработаны и широко используются на практике различные варианты этого метода, позволяющие быстро и эффективно идентифицировать мутации, изучать ДНК-полиморфизмы, применяемые для молекулярного маркирования мутантных хромосом.

Принципиальная схема полимеразной цепной реакции

В настоящее время существуют два основных подхода к пренатальной диагностике, как и вообще к диагностике генных болезней:
- прямая диагностика, основанная на непосредственной идентификации мутаций в определенном гене;
— косвенная (непрямая) диагностика, в основе которой лежит маркирование мутантного гена (иногда называемая маркированием «больной» хромосомы, несущей мутантный ген) с помощью молекулярных маркеров.

Прямая диагностика генных аномалий

Основу прямой диагностики составляет идентификация мутаций в самом гене. Преимущества метода - высокая (приближающаяся к 100%) точность диагностики, возможность проведения ПД, а также анализа информативности (пригодности для молекулярной диагностики) семьи и выявления гетерозиготных носителей при отсутствии больного ребенка.

При отсутствии мажорных мутаций гена требуется детальный молекулярный анализ (сканирование) первичной структуры гена с целью обнаружения мутаций, что можно отнести к недостаткам метода.

В основе любого моногенного заболевания лежат нарушения функций гена, вызванные различными мутациями в его смысловой части, т.е. в последовательности гена, кодирующей синтез белка (кДНК). Тип и спектры мутаций, как и их фенотипическое выражение (тяжесть заболевания) специфичны для каждого гена и в значительной степени определяются уникальными особенностями его первичной структуры (последовательностью нуклеотидов).

Известно также, что частота разных мутаций в каждом гене различна. Существуют часто встречающиеся «мажорные» мутации, диагностическая ценность которых особенно высока, и «минорные» (единичные спорадические), регистрирующиеся крайне редко. Для многих генов, ответственных за наследственные заболевания, спектры мутации хорошо изучены и разработаны оптимальные алгоритмы их идентификации. Так, например, мажорной для гена муковисцидоза является мутация delF508, встречающаяся почти в 50% всех мутантных хромосом у больных муковисцидозом в России, для гена фенилаланингидроксилазы — это мутация R408W, обнаруженная у45% больных фенилкетонурией в России, для гена дистрофина характерны достаточно протяженные делеции, регистрируемые в 60% Х-хромосом у больных миодистрофией Дюшенна и т.д.

Более подробно алгоритмы молекулярной диагностики различных моногенных болезней приведены в специальных руководствах, обзорах.

Источник: http://meduniver.com