Гибридизация мрнк и днк антител. Локализация v- и с-генов в геноме иммуноглобулинов
В опытах по гибридизации различных мРНК и ДНК, особенно ранних, как правило, получались двухфазные кривые с одной зоной перехода в области низких и второй — в области высоких значений Cot4l.
Использование для угнетения гибридизации немеченых мРНК, кодирующих L-цепи с гомологичными или гетерологичными С-областями, позволило уже тогда установить, что высокие значения Cotih обусловлены гибридизацией С-генов и что число этих генов не превышает двух — четырех на гаплоидный геном. Наличие же области с низкими значениями Coth частью исследователей рассматривалось как доказательство наличия значительного числа «зародышевых» V-генов. Однако повышение чистоты препаратов мРНК и использование фрагментов мРНК, содержащих и не содержащих полиА-последовательности, позволило в последние годы установить, что V-гены также являются уникальными и что они представлены в геноме в количестве, не превышающем двух-трех копий.
Рассмотрим в качестве примера данные опытов по гибридизации мРНК, кодирующей синтез ламбда-L-цепи мышиной миеломы МОРС 104Е, с ДНК из печени мышн (Matthyssens е. а., 1976). На основании данных о первичной структуре V-областей все исследованные в настоящее время ламбда-цепи мышей (18 образцов) подразделены на семь подгрупп. Если для каждой V-области существует отдельный V-ген, то в геноме мыши должно обнаруживаться 7 V-генов. На самом деле число их может быть не менее 145 (при этом условии вероятность обнаружения семи разных подгрупп при исследовании всего 18 образцов повышается до 90%- при 50%-ной вероятности число V-генов должно быть не меньше 25). Из кривой гибридизации было определено, что V-ген для L-цепи МОРС 104Е повторяется в геноме не более 2—3 раз. В то же время степень гомологии для двух мРНК, кодирующих синтез двух ламбда-цепей, относящихся даже к двум разным подгруппам (МОРС 104Е и НОРС 2020), весьма велика. Экстраполируя полученные данные на остальные мРНК, кодирующие ламбда-цепи, можно заключить, что при таком сходстве V-областей этих цепей L-мРНК МОРС 104Е должна была бы гнбридизоваться со всеми ими и, следовательно, значения Cot должны были бы быть значительно ниже определяемых на опыте (чем больше повторов, тем ниже значение Cot,,,). Полученные данные говорят, таким образом, против наличия в геноме значительного числа V-генов и, следовательно, в пользу соматических мутаций как основного фактора, обеспечивающего разнообразие антител (иммуноглобулинов).
Необходимо, однако, отметить, что метод гибридизации достаточно сложен и, по-видимому, пока не позволяет однозначно трактовать полученные результаты. Так, в отличие от описанных выше опытов, при использовании кДНК для V- и С-областей в отдельности (кДНК и кДПКс) была обнаружена высокая специфичность гибридизации кДНКу с мРНК (Smith, 1977- Stavnezer, Bishop, 1977). Оказалось, что в то время как кДНКс в равной степени гибридизуется со всеми мРНК, кодирующими L-цепи каппа-типа, кДНКу вступает в реакцию только с гомологичной каппа-мРНК. Это свидетельствует о том, что определяемое методом гибридизации количество V-генов может быть занижено.
В то же время метод гибридизации оказался весьма полезным для изучения локализации V- и С-генов в клеточном геноме. Недавно с помощью этого метода удалось продемонстрировать соматическую реорганизацию генов, кодирующих V- и С-участки иммуноглобулинов. Было показано, что в эмбриональном геноме мыши V- и С-гсны разделены, в то время как в опухолевых (плазмо-нитомы МОРС 321, НОРС 2020) они расположены рядом (слиты).
Кривые гибридизации мРНК с ДНК, выделенной из клеток печени и миеломы, были почти одинаковы. Это означает, что в клетках, продуцирующих иммуноглобулины, не происходит амплификации кодирующих их генов.
Таким образом, в настоящее время установлено, что в геноме имеется 2 или 3 гена, кодирующих V-области ламбда-цепей, 2 или 3 гена, кодирующих V-области каппа-цепей, и 2—4 гена, кодирующих С-области L-цепей.
Сначала происходит соединение V- и С-генов, затем этот участок ДНК плюс еще 200—450 нетранслируемых нуклеотидов транскрибируются в мРНК, которая после присоединения на 3`-конце 200 полиА-нуклеотидов переносится в цитоплазму и включается в состав полирибосом, где кодирует синтез предшественников полипептидных цепей иммуноглобулинов.
После отщепления от предшественников экстрапептидов (а может быть, и до этого) начинается сборка молекул иммуноглобулинов, перенос их в микросомальные везикулы и либо секреция, либо включение в клеточную мембрану.
Источник: http://meduniver.com