Косвенная диагностика генных болезней. Точность молекулярной диагностики

Непрямой (косвенный) подход к молекулярной диагностике исторически является более ранним и более универсальным. Он основан на анализе внутри- и внегенных полиморфных сайтов. В качестве последних обычно выступают короткие ДНК-последовательности одних и тех же гомологичных участков хромосом, различающихся по первичной структуре. Эти диагностические полиморфные сайты могут располагаться либо внутри самого гена, либо в непосредственной близости от него.

Непременным условием косвенной ДНК-диагностики является наличие в семье больного ребенка или возможность исследования его ДНК (пятен крови, гистологических препаратов и др.). Установление информативности предусматривает выявление такого полиморфного сайта, который может быть использован в качестве молекулярного маркера для дискриминации как мутантного, так и нормального аллеля. При этом в случае аутосомно-рецессивных заболеваний родители будут являться гетерозиготами по данному полиморфизму, а больной - гомозиготой по одному из маркерных аллелей. Именно гетерозиготность по молекулярным полиморфизмам определяет информативность той или иной семьи высокого риска рождения ребенка с генной патологией. В зависимости от распределения маркерных аллелей на гомологичных хромосомах больного и его родителей семья может быть полностью информативной для ДНК-диагностики, частично информативной или неинформативной.

Принципиально важно проанализировать в семье высокого риска такое количество полиморфных сайтов одного гена, чтобы точно определить, с каким конкретным аллелем наследуется мутантный ген, и сделать семью полностью информативной для последующей ПД.

Главное преимущество косвенного метода - возможность ДНК-диагностики без точной идентификации мутаций в самом гене и даже при отсутствии данных о точной идентификации и клонировании самого мутантного гена. Его существенными недостатками являются невозможность диагностики при отсутствии больного ребенка (нельзя точно определить, с каким полиморфным аллелем сцеплен мутантный ген), ошибка в диагнозе в связи с возможностью кроссинговера в мейозе и переноса полиморфного сайта на здоровый аллель.

Примеры информативности семьи

Точность молекулярной диагностики, возможные источники ошибок

При проведении пренатальной диагностики молекулярными методами важно помнить о двух основных источниках ошибок:
- контаминации плодного образца материнскими клетками;
- возможности кроссинговера при использовании непрямого метода.

Учитывая очень высокую чувствительность метода ПЦР, важно избежать загрязнения образцов плодных тканей материнскими клетками. Чистота образца для анализа может бьпъ достигнута только путем тщательного отбора ворсинок хориона или плаценты под бинокулярной лупой с последующим отмыванием физиологическим раствором. Особенно важно не допустить попадания материнской крови в случае забора пуповинной крови плода при кордоцентезе. Высокая квалификация врача-оператора и использование качественных реакций на выявление примеси материнской крови позволяют избежать этого осложнения. Риск подобных диагностических ошибок может бьпъ значительно уменъшен при работе в стерильных условиях.

Достоверность молекулярной диагностики прямым методом, т.е. путем идентификации мутаций в самом гене, очень высока и приближается к абсолютной. Однако с учетом всего многообразия возможных изменений в геноме при созревании гамет (кроссинговер) и на начальных стадиях эмбриогенеза (мутагенный эффект) более точным является показатель диагностики около 99,9%. Значительно сложнее оценить результаты молекулярной диагностики косвенным методом. В случае учета внутригенных полиморфизмов точность непрямой диагностики достаточно высока, так как величина внутритенного кроссинговера, как правило, не превышает 0,1 % для большинства известных генов.

Исключение могут составлять только сравнительно крупные гены, такие как ген дистрофина, гемофилии А, нейрофиброматоза и некоторые другие. Так, в случае дистрофина частота ошибочного диагноза может достигать 2%, что соответствует высокой частоте внутритенного кроссинговера (около 2%) в этом гигантском гене (2,2 млн п.о.). Важно также учитывать степень родства больного и пробанда, у которого проводится ПД. Величина возможной ошибки возрастает, если маркерный аллель определяется не у сибса плода, а у других его родственников. Особенно осторожно следует оценивать результаты непрямой диагностики с использованием внегенных полиморфных локусов. Считается, что с уверенностью проводить ПД в этих случаях можно только при одновременном тестировании нескольких полиморфных сайтов, фланкирующих мутантный ген. Обычно для молекулярной диагностики используют маркеры, частота рекомбинаций которых с мутантными аллелями гена не превышает десятых или сотых долей процента. Характеристика ДНК-полиморфизмов, последовательности праймеров для ПЦР, величины погрешности непрямых методов для различных заболеваний, диагностируемых пренатально, приведены в монографии и обзорах.

Источник: http://meduniver.com