Мутации, приводящие к наследственным заболеваниям у человека

При блоттинге по Саузерну исследуемая ДНК после расщепления рестриктазами фиксируется на специальной мембране. Зонд — особым образом меченный фрагмент одноцепочечной ДНК, комплементарный части последовательности изучаемого гена, — связывается с мембраной- таким образом можно выявить делеции или вставки в гене. Поскольку для блоттинга по Саузерну требуется больше ДНК, а метод является более трудоемким и длительным, с его помощью, как правило, выявляют только те заболевания, которые обычно вызываются генными делениями. В ходе ПЦР синтезируется большое число копий изучаемого фрагмента ДНК — таким образом, меченый зонд в данном случае не нужен. С помощью гель-электрофореза и определения нуклеотидной последовательности полученного продукта можно точно установить, какие в этой последовательности имеются изменения.

Хотя с помощью блоттинга по Саузерну чаще выявляются делении, на самом деле на них приходится лишь около 10% всех мутаций. Есть некоторые примечательные исключения: например, недостаточность стеролсульфатазы (в 90% случаев обусловлена делениями целого гена), миопатия Дюшенна (у 60% больных имеются делеции в гене дистрофина) и муковисцидоз (60—70% случаев обусловлены делецией трех пар нуклеотидов). Для выявления делеций, приводящих к недостаточности стеролсульфатазы, можно использовать блоттинг по Саузерну, но более мелкие делеции, как в случае миопатии Дюшенна и муковисцидоза, требуют ПЦР.

Чаще всего наследственные заболевания у человека вызваны точечными мутациями. Последствия мутации во многом зависят от ее типа. Миссенс-мутация приводит к замене одной аминокислоты на другую- в зависимости от локализации и типа аминокислотной замены она может сказаться или не сказаться на функции белка. Чтобы доказать что причиной заболевания является именно данная миссенс-мутация, как правило, исследуют функцию соответствующего белка in vitro. При нонсенс-мутации смысловой кодон заменяется терминирующим, и при трансляции получается укороченный нефункциональный белок. Сигналом к окончанию трансляции для рибосомы служат три кодона — ТГА, ТАГ и ТАА (в ДНК). Если в результате мутации кодон ТАЦ в нормальном аллеле превратится в ТАА, трансляция в этой точке будет останавливаться. Мутации со сдвигом рамки считывания — это делеции либо вставки нуклеотидов в количестве, не кратном трем, так что ниже места мутации изменяется разбиение последовательности ДНК на кодоны. Из-за этого полностью меняется аминокислотная последовательность и значительно возрастает вероятность преждевременного появления терминирующего кодона. При несмысло-вой мутации аминокислотная последовательность белка не меняется. Иногда такие мутации влияют на уровень транскрипции мРНК, что приводит к заболеванию. Кроме того, нонсенс- и миссенс-мутации также могут снижать экспрессию гена, подобно мутациям сплайсинга (при которых сплайсинг нарушается либо появляется новый сайт сплайсинга).

При некоторых заболеваниях точечные мутации могут быть идентичными у всех больных, но это крайне редкий случай. Гораздо чаще (примером может служить -талассемия) выявляется целый ряд точечных мутаций, как правило, уникальных для конкретной семьи. Кроме того, распространенность некоторых мутаций зависит от этнической принадлежности. Например, у евреев-ашкенази при болезни Тея—Сакса более чем в 90% случаев выявляют одну из трех мутаций в гене гексозаминидазы А. Однако среди больных нееврейского происхождения эти три мутации обнаруживаются лишь в 20% случаев.

Еще один тип мутаций — увеличение числа тринуклеотидных повторов — обнаружен сравнительно недавно. Некоторые гены в норме содержат определенное число тринуклеотидных повторов, что не приводит к мутантному фенотипу. Однако если число повторов возрастает свыше определенного предела (вероятнее всего, в половых клетках или на ранних стадиях развития эмбриона), развивается заболевание. Пример, имеющий значение для специалистов по лечению бесплодия, — синдром ломкой Х-хромосомы, который наследуется доминантно, сцепленно с Х-хромосомой (с неполной пенетрантностью), и проявляется умственной отсталостью, макроорхизмом и своеобразными чертами лица (большие уши и массивная нижняя челюсть). У женщин может наблюдаться преждевременная недостаточность яичников (см. ниже). Ген FMR1, расположенный в ломком участке Х-хромосомы (локус Xq27), в норме содержит от 5 до 50 повторов последовательности ЦЦГ. У женщин-носительниц число повторов увеличено (50—200) — так называемая премутация. У таких носительниц число повторов может превышать 200 и даже 1000, в этом случае у их сыновей проявляется синдром ломкой Х-хромосомы.

Увеличение числа тринуклеотидных повторов объясняет такую особенность аутосомных заболеваний, как антиципация — явление, когда в каждом следующем поколении заболевание протекает все тяжелее. Например, у женщины с легкой формой атрофической миотонии (небольшая слабость мимических мышц) рождается ребенок с тяжелой врожденной атрофической миотонией, который умирает от тяжелого поражения сердца. В общем случае тяжесть проявления заболевания от поколения к поколению растет с увеличением числа тринуклеотидных повторов.