Офтальмология-содержание глутаминовой кислоты в камерной влаге у больных первичной открытоугольной глаукомой

Glutamicacid concentration in aqueous humor of open angle glaucoma patients

By many authors glutamate renders neurotoxiceffect on retinal ganglion cells. It is possible that glutamicacid concentration increase in eye tissues with primary open angleglaucoma (POAG) plays an important role in optic nerve glaucomaatrophy pathogenesis.

Aqueous humor of 10 patients with POAG were taken during cataractextraction and examined. The quantities of glutamic acid weredetermined by chromatographic method.

Glutamic acid concentration in aqueous humor of control groupwas 28.6±1.6 mkg/ml and in group with POAG – 84.9±28.7 mkg/ml.The difference wasn’t statistically reliable. Thus there is atendency to glutamic acid concentration increase in eyes withPOAG.

Результаты исследований последнихлет существенно повлияли на представления о патогенезе глаукоматознойатрофии зрительного нерва – глаукоматозной оптической нейропатии.

Было установлено, что характерным проявлением глаукоматознойоптической нейропатии является апоптоз – гибель ганглиозных клетоксетчатки. Quigley [6] считает, что поврежденный, возможно, вследствиевысокого ВГД, аксон ганглиозной клетки сетчатки не несет достаточнойинформации, что приводит к активации механизмов естественной гибеликлетки. Возможно, эти процессы активизируются недостаточностьюкровотока в сосудах глаза при повышенном ВГД. Было показано, чтоодновременно с этим имеется значительное увеличение содержанияглутаминовой кислоты (глутамата) в стекловидном теле больных первичнойоткрытоугольной глаукомой (ПОУГ). Глутамат является основным нейромедиаторомЦНС и сетчатки. В то же время повышение концентрации глутаматавыше физиологического уровня вызывает в сетчатке блокаду межнейрональнойпередачи нервных импульсов и сочетается с селективным апоптозомганглиозных клеток сетчатки из–за нейротоксического действия глутамата[5]. Brooks D.E. et al. [7] обнаружили в собачьих глазах с экспериментальновызванной глаукомой повышенное содержание витреального глутамата,триптофана и низкое содержание глицина по сравнению с контролем.По мнению авторов, высокая концентрация глутамата токсична дляганглиев сетчатки и доказывает ишемический механизм нарушений,происходящих в клетках сетчатки.

Сама по себе идея о нейротоксическом действии глутамата на нервнуюткань, в частности, на ганглиозные клетки сетчатки, заимствованаиз неврологической практики. Неврологи около 20 лет придают значениебольшим концентрациям данного трансмиттера в развитии такой патологии,как болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, деменция, амиотрофическийбоковой склероз и другие [4]. Повышенное содержание глутаматав стекловидном теле больных глаукомой, гибель ганглиозных клетоксетчатки под его воздействием в опытах на крысах позволили E.B.Dreyer и соавт. [6] предположить, что данный механизм их гибелиимеет место и при ПОУГ. Однако причина внутриклеточного выпускаглутамата не полностью ясна. E.B. Dreyer и соавт. [6] считают,что, возможно, высокое внутриглазное давление приводит к выходуглутамата во внутриклеточные пространства, вызывая гибель клеток,который токсичен для ганглиозных клеток. Второй вероятной причинойгибели клеток, по мнению авторов, является сбой в ферментных системах,ответственных за разрушение данного нейромедиатора после выходаего из синапсов. Трудность подтверждения этих воззрений заключаетсяв том, что очень трудно проверить данные факты на «живом» глазу,однако несомненно, что большие концентрации гутамата токсичныдля нервной ткани.

Учитывая вышесказанное, целью нашего исследования явилось обнаружениеглутамата у больных ПОУГ.

Материалы и методы исследования

Опытную группу составили 10 больных ПОУГ(6 мужчин, 4 женщины, средний возраст – 74 года), у которых забираласькамерная влага во время экстракапсулярной экстракции катарактыс антиглаукоматозным компонентом. 8 больных были с развитой стадиейПОУГ, 2 с далекозашедшей. Контрольную группу составили больныесо старческой катарактой – 14 пациентов (11 мужчин, 3 женщины,средний возраст – 68 лет). Основная и контрольная группы былисопоставимы по возрасту и сопутствующим соматическим заболеваниям.

В основу метода положены описанные Боде и Гири методы количественногоопределения аминокислот в виде медных производных с нингидридиномпосле хроматографического их разделения на бумаге в нашей модификации[1].

1. Подготовка пробы для анализа. Пробы камернойжидкости объемом 0,1–0,2 мл взвешивают на аналитических весах,упаривают досуха на водяной бане при 40°С в стеклянных микрочашках,используя плавающий штатив. Сухой остаток растворяют в 0,05 млдистиллированной воды.

2. Получение одномерных хроматограмм камерной жидкостиглаза. 20 мкл полученных растворов порциями по 5 мкл спомощью автоматической пипетки наносят на хроматографическую бумагумарки «быстрая» размером 2 x 27 см. Хроматографирование проводятнисходящим методом два раза в одном направлении сначала в смесирастворителей I, затем два раза в смеси II. Смесь I: н–бутиловыйспирт, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода (4 : 1: 5). Смесь II: н–бутиловый спирт, ледяная уксусная кислота, дистиллированнаявода (40 : 15 : 5). После каждого пропускания растворителя бумагувысушивают на воздухе и снова помещают в хроматографическую камеру.Время прохождения растворителя в одном направлении 7 часов. Высушеннуюхроматограмму погружают на несколько секунд в 0,5% раствор нингидринав ацетоне, просушивают в течение нескольких минут на воздухе иподогревают 10 минут в сушильном шкафу при 50°С для развития окраски.Пятна аминокислот становятся более четкими через сутки, поэтомуопределение количественного содержания аминокислот следует проводитьна следующий день.

3. Количественное определение глутаминовой кислоты в камернойжидкости глаза. Фиолетовые пятна, соответствующие глутаминовойкислоте, вырезают, разрезают на мелкие кусочки и помещают в микропробирки,содержащие 0,25 мл спиртового раствора сульфата меди. Фиолетоваяокраска переходит в оранжево–красную в результате образованиямедного производного аминокислот с нингидрином. Экстракцию продолжаютв течение одного часа при комнатной температуре. Интенсивностьокраски измеряют на фотоэлектроколориметре Humalyzer 2000 придлине волны 505 нм в микрокюветах против контрольной пробы набумагу. Расчеты по содержанию аминокислоты проводят по калибровочномуграфику, полученному со стандартными растворами глутаминовой кислоты.

4. Построение калибровочного графика. Готовятрастворы глутаминовой кислоты 0,001 М, 0,00075 М, 0,0005 М, 0,000375М, 0,00025 М. На бумагу наносят по 20 мкл растворов. Расчет производятпо формуле:

А = (С x 5 x 10^–2)/V

А – концентрация глутаминовой кислоты в камерной влаге (мкг/мл)-C – содержание глутаминовой кислоты, найденной по калибровочномуграфику (мкг/мл)- V – объем проб (мл).

Результаты исследования и обсуждение

Содержание глутамата камерной влаги в контрольнойгруппе составило 28,6±1,6 мкг/мл, при ПОУГ – 84,9±28,7 мкг/мл(разница статистически недостоверна, p>0,05).

Хотя нами и не получено статистически достоверных различий всодержании глутамата у больных ПОУГ и возрастной катарактой, однакоимеется явная тенденция к более высокой концентрации данного нейромедиаторав камерной влаге больных ПОУГ. У 5 из 10 больных ПОУГ содержаниеглутамата в камерной влаге было значительно выше, чем в контрольнойгруппе и колебалось в пределах от 37,6 мкг/мл до 260,3 мкг/мл.

У больных старческой катарактой наивысшая концентрация глутаминовойкислоты составила всего 33 мкг/мл.

Участие некоторых нейромедиаторов в регуляции офтальмотонусапоказано в работах А.В. Мягкова [2,3], который доказал влияниеопиоидных пептидов на повышение ВГД, воздействуя электрическимиколебаниями и химическими раздражителями на миндалевидный комплекс.В результате полученных данных нельзя не согласиться с гипотезойусиления апоптоза ганглиозных клеток сетчатки при ПОУГ вследствиенакопления в них глутаминовой кислоты. Однако данная гипотезатребует дальнейшего изучения.

Проведенные исследования впервые позволили обнаружить глутаминовуюкислоту в камерной влаге у больных ПОУГ. Содержание глутаматау больных ПОУГ выше, чем в контрольной группе.

Литература:

1. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Медицинскиелабораторные технологии. Справочник в 2 томах / Под ред. А.М.Карпищенко// Микрометод определения свободных аминокислот в сывороткекрови при помощи хроматографии на бумаге. Т.2. – С–Петербург,«Интермедика», 1999. – С. 106–109

2. Мягков А. В. Влияние пунктурных воздействий на офтальмогипертензию,вызванную электрической и химической стимуляцией миндалевидногокомплекса: Авореф. дисс. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук.– Казань, 1997 – 21 с.

3. Мягков А.В. Участие опиоидных пептидов в центральной регуляциивнутриглазного давления и гидродинамики глаза // Тез. Докладов7съезда офтальмологов России. – М., 2000.– С.175–176.

4. Пляхин И.В. Биохимические основы пролонгируемой клеточнойсмерти. // Межрегиональный сборник научн. Трудов / Биохимия нарубеже XXI века. – 2000.– Рязань. – С.173–177.

5. Шамшинова А.М., Зуева М.В., Цапенко И.В., Яковлев А.А. Нейрофизиологическиеособенности сетчатки и возможности клинической электроретинографии.//Вестн. Офтальмол. – 1996.– №2.– С.52–55.

6. Occurrences of glaucoma in the document // slackinc.com),Ocular Surgery News International Edition, December 15, 1996

7. Vitreousbody glutamate concentration in dogs with glaucoma / Brooks D.E.,Garcia G.A., Dreyer E.B. at all // Am. J. Vet. Res. – 1997.– Vol.58,N8.– P.864–867