Медицинское законодательство: права, документы, обязанности, нормы, акты.

УтвержденыГлавным государственнымсанитарным врачомРоссийской Федерации -Первым заместителемМинистра здравоохраненияРоссийской ФедерацииГ.Г.ОНИЩЕНКО9 января 1998 годаДата введения - 8 июня 1998 года4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИМЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯМУ 4.2.698-981. Разработаны сотрудниками Федеральной референс - лабораториидиагностики дифтерийной инфекцииМосковскогонаучно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н. Габричевского (д.м.н. Мазуровой И.К., к.м.н. Мельниковым,к.б.н. Комбаровой С.Ю., Борисовой О.Ю.) и ДепартаментомГоссанэпиднадзора Минздрава России (Жилиной Н.Я.).2. Утверждены и введены в действие главным государственнымсанитарным врачом Российской Федерации, первым заместителемМинистра здравоохранения Российской Федерации от 8 апреля 1998 г.3. ВведенывзаменМетодическихуказаний4.2.589-96"Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции".1. Область примененияМетодические указания составлены в помощь специалистамбактериологических лабораторий санитарно - эпидемиологичоскойслужбы, лечебно - профилактических учреждений и научно -исследовательских институтов для совершенствования лабораторнойдиагностики дифтерийной инфекции.2. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекцииВозбудителем дифтерийнойинфекцииявляются токсигенныеCorynebacterium diphtheriae. Нетоксигенные коринебактерии дифтериине вызывают дифтерийную инфекцию. "Этиологическая" значимость этихмикроорганизмов при неинфекционной патологии (фарингит, артрит,эндокардит и др.) требует специальных доказательств. При выделениинетоксигенных штаммов С.diphtheriae от больных с подозрением надифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильностьпроведения бактериологического исследования и оценку токсигенныхсвойств.В основе способности С. diphtheriae вырабатывать экзотоксинлежит феномен фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсиянетоксигенных штаммов С. diphtheriae в токсигенные и наоборотвоспроизводится только в особых, экспериментальных условиях. В техслучаях, когда при первичном посеве исследуемого материала отбольных дифтерией выделяют токсигенные, а при повторныхобследованиях после лечения антибиотиками - нетоксигенныекоринебактерии дифтерии, можно предположить, что при использованииантибиотиков в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, какболее чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммыпродолжают выделяться. Такое же положение может создаваться и присанации антибиотиками бактерионосителей, одновременно выделяющихтоксигенные и нетоксигенные коринебактерии дифтерии. Обнаружение утаких носителей при повторных обследованиях только нетоксигенныхштаммов нельзя трактовать как утрату способности штаммовпродуцировать экзотоксин.Таксономически близкими виду С.diphtheriae являются C.ulceransи C.pseudotuberculosis (C.ovis). Данные микроорганизмы - природныепатогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей. Отмеченаспособность этих видов бактерий вырабатывать токсин, подобныйдифтерийному. Встречаются и "нетоксигенные" штаммы. Известныслучаи выделения "токсигенных" C.ulcerans при клинической картинезаболевания, сходной с дифтерией.На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме частовстречаетсяложнодифтерийнаяпалочка Гофмана(C.pseudodiphtheriticum). Умение выделять и идентифицироватьданные бактерии служит критерием оценки качества работыбактериологов в межэпидемический период.Все микроорганизмы рода Corynebacterium являютсяграмположительными палочками, не образующими спор, обладающимиразличной степенью полиморфизма. Большинство видов лучше растет ваэробных условиях.Обычно колонии микроорганизмов из рода коринебактерий наплотных питательных средах (например, на кровяном агаре) имеютсеровато - белую или желтоватую окраску, непрозрачные илиполупрозрачные, округлой формы, диаметром 1 - 3 мм. Чаще всего онибывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды родакоринебактериимогутобразовывать шероховатые R-колонии.Представители этого рода не отличаются высокой ферментативнойактивностью. C.diphtheriae растут при 37ш C, устойчивы к низкойтемпературе, чувствительны к высокой. Все дезинфицирующие веществав обычных концентрациях (3 - 5%) уничтожают коринебактериидифтерии в течении 20 - 30 минут. Токсигенные C.diphtheriae болеечувствительны к антибиотикам, чем нетоксигенные. Возможнопоявление устойчивых к антибиотикам штаммов. Широко определятьчувствительностькантибиотикам штаммов, выделенных отбактерионосителей, не следует из-за несоответствия результатовлабораторной пробы с действием антибиотиков на возбудителядифтерии в организме человека.Для C.diphtheriae характерен значительный полиморфизм -разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы,ракетки, овода и т.д. Взаиморасположение клеток напоминает римскиецифры X, V. При окраске часто обнаруживается выраженнаявнутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зеренволютина. Описано сродство волютина к метиленовому синему и, приобработке этим красителем, гранулы или полоски (скопления гранул)прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаяхможет приобрести розовыйоттенок.Использованиевбактериологической практике окраскипоГрамуявляетсянецелесообразным,посколькуклеткиC.diphtheriaeлегкообесцвечиваются спиртомимогутвыглядетьвмазкеграмвариабельными или даже грамотрицательными.Для C.ulcerans и C.pseudodiphtheriticum характерна склонностьк параллельному расположению клеток. 24 - 48-часовые культуры этихвидов имеют чаще всего овоидную форму клеток.По форме колоний и некоторым биохимическим свойствамC.diphtheriae подразделяют на культурально - биохимическиеварианты - gravis, mitis, intermedius.Через 48 - 72 часа роста вариант mitis образует колонииS-типа - гладкие, диаметром 1 - 2 мм- S-R-колонии варианта gravisобычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2 - 3 мм-колонии варианта intermedius - S-типа, мелкие, плоские, гладкие, сровным краем, диаметром 0,5 - 1 мм. Далее описываются только двакультурально - биохимических варианта - gravis и mitis, так какбиовар intermedius встречается редко и по биохимическим свойствамне отличается от биовара mitis.На кровяных теллуритовых средах через 48 часов роста колонииC.diphtheriae варианта gravis, как и колонии C.ulcerans, черные,матовые имеют радиальную исчерченность. КолонииC.pseudodiphtheriticum имеют характерный светлый ободок.В бактериологическойпрактикеопиратьсятолько наморфологические свойства колоний или микробной клетки, приидентификации C.diphtheriae, не представляется возможным. Описаныслучаи бактериологической гипо- и гипердиагностики (в 55% и 14,5%случаев соответственно), когда используется учеттолькоморфологических признаков. При идентификации C.diphtheriaeнеобходимо использовать комплекс тестов, в первую очередь,определение патогенности (токсигенности), основного признакавозбудителя дифтерии.Определение токсигенных свойств проводится бактериологами впервые сутки роста подозрительных колоний на чашках первичногопосева материала. Во избежание ошибок при определении токсигенныхсвойств коринебактерий, необходимо изучать данный признак умаксимального числа выросших колоний с чашек первичного посева.При соблюдении описанных ниже методик можно изучить токсигенностьболее чем у 20 подозрительных колоний из одного анализа. Нельзяизучать материал при множественном росте подозрительных колонийтолько в одной - двух бляшках.Ферментативная активность микроорганизмов изучается путемопределения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять докислоты глюкозу, сахарозу, крахмал. В редких случаях, когданеобходимо идентифицировать C.ulcerans, добавляется тест навосстановление нитратов в нитриты.Учитывая, что при идентификации возбудителя дифтерийнойинфекции ведущим элементом является определение наличия токсина,оценкидругихсвойствимеет вспомогательное значение.Использование "длинного" углеводного ряда является излишним приидентификация C.diphtheriae.Практическимбактериологам,занимающимся лабораторной диагностикой дифтерии, не требуетсяпроводить идентификацию до вида других микроорганизмов родаCorynebacterium. В то же время, в лабораториях, где проводитсядиагностика заболеваний, вызываемых "недифтерийными"коринебактериями, недостаточно использования даже "длинного"углеводного ряда. Для точной идентификации данных микроорганизмовнеобходимо использовать хемотаксономические методы исследования,например, такие, как определение наличия миколовых кислот всоставе клеточной стенки бактерий и некоторые другие.Таким образом, выделенный микроорганизм является возбудителемдифтерии, если он обладает токсигенными свойствами, определеннымспектром ферментативной активности (расщепление глюкозы, крахмала,отсутствие разложения сахарозы, наличие фермента цистиназы,отсутствие ферментауреазы)и характерными морфолого -культуральными признаками (образование колоний черного или серогоцвета на кровяно - теллуритовых средах, с учетом, принеобходимости, морфологии клеток - полиморфные, не образующие спорпалочки).3. Бактериологическое исследованиеБактериологическое исследование проводят с целью лабораторнойдиагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции инаблюдения за распространенностью токсигенных коринебактериидифтерии.ВЗЯТИЕ И ДОСТАВКА МАТЕРИАЛА1. Успех бактериологического исследования в значительнойстепени зависит от своевременного и правильного взятия материала.2. Взятие материала должны производить специально обученныемедицинские работники лечебно - профилактических учреждений.3. При исследовании на дифтерию обследуют ротоглотку и нос.При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, влагалище)помимо пораженных участков, следует брать материал также сминдалин и из носа.4. Взятие материала осуществляют с помощью стерильных ватныхсухих тампонов. Для их приготовления используют деревянные илиметаллические (из нержавеющего металла) палочки, на один из концовкоторых плотно накручивается слой гигроскопической ваты (примерно120 мг ваты на тампон). Тампоны должны иметь форму "капли", а не"веретена". Тампоны монтируют в пробирки с корковыми или ватнымипробками так, чтобы конец тампона не касался дна и стенокпробирки. Стерилизуют тампоны в сухожаровом шкафу при температуре140ш C в течение часа или в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин.5. Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами,натощак или не ранее, чем через два часа после еды, при хорошемосвещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка ивнутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собираютматериал с пораженных участков ротоглотки - миндалин, а принеобходимости - с дужек мягкого неба, небного язычка или заднейстенки глотки. При наличии налетов, материал следует брать сграницы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на нихтампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон,который вводят сначала в один, а потом в другой носовой ход, некасаясь крыльев носа снаружи.6. При ларингоскопии материал (слизь, пленка) собираютнепосредственно из гортани. Материал с пораженных участков кожиследует собирать сухим тампоном после удаления корочек или струпа.7. Тампоны должны бытьдоставлены в лабораториюнепозднее 3-х часов с момента взятия материала. При проведенииобследования контингентов в отдаленных от бактериологическихлабораторий районах, рекомендуется засевать материал на чашки спитательной средой или использовать транспортную среду.8. В случае использования транспортной среды материал собираютсухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем,чтобы пробка тампона не намокла. Следует учитывать, что применениетранспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответана одни сутки.9. Чашки (или пробирки с транспортной средой) с посевомисследуемого материала можно поместить для подращивания втермостат при 37ш C на 15 - 18 часов, после чего доставить влабораторию.10. При транспортировке на дальние расстояния также можноиспользовать тампоны, предварительно пропитанные растворомглицерина. Тампон пропитывают 5-процентным раствором глицерина вдистиллированной воде, отжимают о стенки сосуда с раствором,укрепляют в пробирке так же, как сухой тампон и автоклавируют при0,5 атм. в течение 30 мин.11. Холодное время года исследуемый материал доставляют вбаклабораторию в сумках - термосах, во избежание его замерзания.12. Вслучаенеобходимости проведения постмортальныхисследований на коринебактерии дифтерии, материал целесообразнобрать с миндалин, гортани и полости носа, поскольку во внутреннихорганах возбудитель обнаруживается редко.13. Каждой пробирке с исследуемым материалом (зев, нос илидругая локализация) придается номер. В прилагаемом спискеуказывается номер пробирки, фамилия, имя (или инициалы), возраст,название учреждения, направляющего материал, или домашний адресобследуемого, цель обследования (диагностическая с указаниемдиагноза, по эпидпоказаниям, профилактическое обследование), датаи время взятия материала.ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ. ПЕРВЫЙ ДЕНЬПосев материала.Материал для исследования из ротоглотки, носа или другихпораженных мест засевают раздельно на поверхность одной изрекомендуемых плотных питательных сред, разлитых в чашки Петри.Посев от одного лица производят на одну чашку, используя приэтом половину поверхности среды для посева материала изротоглотки, а вторую - для посева материала из носа. При посевематериала с кожи или других мест добавляют еще одну чашку. Недопускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона научастке площадью 2 x 1 кв. см - формирование такой "площадки"является обязательным. Затем этим же тампоном засевают оставшуюсяповерхность 1/2 чашки. Посев производят частыми неперекрывающимисяштрихами, не отрывая тампон от поверхности питательной среды и неизменяя положения тампона. Такой метод посева позволяет засеятьвесь материал с тампона, получить изолированные колонии (чистуюкультуру) для дальнейшей идентификации непосредственно на чашкепервичного посева, что сокращает длительность анализа на однисутки. Засеянные чашки или пробирки с транспортной средой помещаютв термостат при 37ш C. Высев из транспортной среды производят наследующие сутки на плотную питательную среду тампоном, отжатым остенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.Посев следует производить на чашки со средой, согретые прикомнатной температуре или в термостате (15 - 20 минут).ВТОРОЙ ДЕНЬ1. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 часапосле посева материала (если материал засевали во второй половинедня, то просмотр осуществляется ровно через 24 часа, т.е. тоже вовторой половине дня) визуально или с помощью микроскопабинокулярного стереоскопического (МБС).2. Чашки с колониями, похожими на дифтерийные, отбирают длядальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопиипрепаратов - мазков из "подозрительных" колоний можно непроводить. "Подозрительные" колонии на кровяно - теллуритовыхсредах через 24 часа роста светло - серого цвета, выпуклые, сровными краями, через 48 часов - серые с металлическим оттенком, сровнымиили слегка изрезанными краями, крошащиеся приприкосновении петлей или мягкой консистенции. Из "сомнительных"колоний готовят препараты - мазки.Клетки коринебактерий дифтерии из культуры, выросшей на средахс ингибиторами роста (теллурит калия, хинозол) могут бытьукорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизмсохраняются. Оценка морфологических признаков не позволяетустановить видовую принадлежность микроорганизма, но даетвозможность предположительно отнести его к роду коринебактерий.Если при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для родакоринебактерий, то эти колонии отбирают для дальнейшейидентификации по всем тестам. В случае обнаружения других форммикроорганизмов (кокков, дрожжей, споровых палочек), дальнейшееизучение этих колоний прекращается.3. В случае роста "подозрительных" однотипных колоний,необходимо сразу же приступить к изучению их токсигенных свойств.Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированныхколоний путем посева одной половины каждой колонии на среду дляопределения токсигенности и, необожженой петлей, - на среду Пизу,а другой половины колонии - в пробирку со скошенным сывороточнымагаром для сохранения и накопления культуры. При невозможностиснять 1/2 колонии для посева на токсигенность и на среду Пизуиспользуется материал целой колонии- посев на скошенный агарисключается и, в дальнейшем, используется культура из пробирки спробой Пизу. Учитывая, что через 24 часа роста колонии имеютнебольшие размеры и материала 1/2 или 1 колонии может бытьнедостаточно для накопления дифтерийного токсина в пробе натоксигенность, а также то, что в исследуемом материале могутнаходиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидностикоринебактерий дифтерии, крайне важно изучить токсигенныесвойства, по возможности, у максимального числа выросших колоний(20 и более), смешивая по 5 - 7 однотипных колоний в одну бляшку.4. При невозможности постановки пробы на токсигенностьклассическим способом (см. п. 3) из-за недостаточной величиныколоний, их изучают, смешивая однотипные колонии в несколькихбляшках. Не прожигая петли, производят посев в среду Пизу. Чашки спервичным посевом исследуемого материала вновь помещают втермостат на 24 часа и просматривают их повторно (на третьисутки).5. Если вырастает только одна колония, ее можно засеять насреду для определения токсигенности и, не обжигая петли, в столбиксреды Пизу для определения цистиназы. Для дальнейшей идентификацииможно использовать культуру из пробирки с пробой Пизу или с бляшкичерез 48 часов роста, или через 24 часа роста при выявленныхтоксигенных свойствах культуры.6. С целью выдачи предварительного ответа, в случаемножественного роста подозрительных колоний, можно произвестипосев нескольких колоний на жидкую питательную среду дляпостановки РНГА, пополнить дополнительную пробу Заксе (3 -5 однотипных колоний, учет через 30 мин. инкубации) и пробу Пизу(5 - 6 однотипных колоний, учет через 3 часа инкубации). Прихарактерной для коринебактерий дифтерии морфологии колоний в МБС,морфологии клеток при микроскопии, отрицательной пробе Заксе,положительных результатах пробы Пизу, РНГА, можно выдатьпредварительный ответ об обнаружении культуры, подозрительной накоринебактерии дифтерии через 48 часов (на третьи сутки) с моментапервичного посева исследуемого материала.ТРЕТИЙ ДЕНЬ1. Через 24 часа, при появлении специфических линийпреципитации на среде для определения токсигенности, положительнойпробе на цистиназу, изучаемую культуру идентифицируют каккоринебактерий дифтерии токсигенные и выдают документированныйответ.При отсутствии специфических линий преципитации на среде дляопределения токсигенности, чашки инкубируют еще 24 часа.2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или спробы Пизу (после оценки ее чистоты), засевают на среды дляопределения биохимического варианта (сахароза, глюкоза, крахмал) ифермента уреазы (гидролиз мочевины).3. Чашки с первичным посевом исследуемогоматериалапросматривают визуально или с помощью МБС повторно через 36 -48 часов инкубации в термостате. При наличии "подозрительных"колоний изучают их токсигенные свойства, цистиназную активность ивыделяют чистую культуру на скошенныйсывороточный агар(см. второй день исследования, п. 3).При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактериидифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтериине выявлены.При отсутствии роста на чашках первичного посева через48 часов инкубации, в ряде случаев требуется повторное взятие иисследование материала. Полное отсутствие роста чаще всегосвидетельствуетонарушенииправилбактериологическогообследования (взятия, доставки, посева и культивированияисследуемого материала).ЧЕТВЕРТЫЙ ДЕНЬ (ИЛИ ПЯТЫЙ)1. При появлении специфических линий преципитации на среде дляопределения токсигенности (через 24 часа инкубации пробы натоксигенность 48-часового роста первичного посева), положительнойпробе на цистиназу выдают документированный ответ о выделениитоксигенных коринебактерий дифтерии.2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или спробы Пизу, после определения ее чистоты, засевают на среды дляизучения биохимических свойств (среды Гисса с сахарозой, глюкозой,крахмалом, проба Заксе или бульон с мочевиной).3. Повторно (через 48 часов) учитывают результаты пробы натоксигенность, поставленной во 2 день исследования. Одновременнопроизводят учет сахаролитических свойств и уреазной активности впробах, поставленных в 3 день исследования.При отсутствии специфических линий преципитации через 48 часовпосле постановки пробы на токсигенность, но при положительныхрезультатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных результатахпроб на уреазу и сахарозу, культуру идентифицируют каккоринебактерии дифтерии нетоксигенные, с указанием биохимическоговарианта.При выделении токсигенных коринебактерий дифтериидополнительно выдают ответ о биохимических свойствах (через 72 или96 часов с момента первичного посева исследуемого материала).БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ1. Наличие специфических линий преципитации при определениитоксигенныхсвойств,положительная проба на цистиназу,отрицательная проба на уреазу, характерные культуральные ибиохимические свойства (сахароза, глюкоза, крахмал) позволяютзаключить, что выделенная культура относится к виду коринебактерийдифтерии, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.2. Отсутствие специфических линий преципитации при определениитоксигенныхсвойств,положительная проба на цистиназу,отрицательная проба на уреазу, характерные культуральные ибиохимичекие свойства позволяют заключить, что выделенная культураотносится к виду коринебактерий дифтерии, нетоксигенная,биохимического варианта гравис или митис.3. При наличии линий преципитации, идентичных специфическимлиниям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительныхпроб на уреазу, цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала,отсутствии ферментации сахарозы, отсутствии редукции нитратов внитриты, культуру относят к виду коринебактерий ульцеранс,токсигенный вариант.При отсутствии линий преципитации при определении токсигенныхсвойств и наличии всех других признаков, характерных длякоринебактерий ульцеранс, нетоксигенный вариант, ибактериологический ответ считают отрицательным.4. При выделении коринебактерий Гофманаилидругихдифтероидов, бактериологический ответ считают отрицательным.5. В некоторых случаях, при диагностическом обследовании и поэпидпоказаниям, может быть выдан предварительный ответ. Этотребует постановки дополнительных проб, наличия качественныхпитательных сред, тест - системы для постановки РНГА и специальнообученного персонала. Предварительный ответ может быть выдан приналичии множественного роста однотипных "подозрительных" колонийна чашках первичного посева после 24 часов инкубации (см. второйдень исследования, п. 6).Предварительный ответ может быть изменен после окончаниябактериологического исследования.6. Штаммы коринебактерий дифтерии с атипичнымиморфологическими, биохимическими,токсигенными свойствами иштаммы коринебактерий ульцеранс следует направлять в федеральнуюреференс - лабораторию по диагностике дифтерийной инфекции приМосковском НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н. Габричевского для дальнейшего изучения, (125212 Москва,ул. адмирала Макарова, 10).СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ1 деньПосев исследуемогоматериала на селективнуюдифференциально - диагностическую или, при необходимости, втранспортную среду. Инкубирование в термостате при 37ш C.2 день (24 часа)1. Изучение выросших колоний, при возможности - постановкапробы на токсигенность, цистиназу и посев культуры на скошенныйсывороточный агар.2. При использовании транспортной среды необходимо произвестипересев на селективную дифференциально - диагностическую среду.3. При множественном росте, в случае необходимости, можнопровести исследования для выдачи предварительного ответа -дополнительные пробы Пизу, Заксе и посев "подозрительных" колонийв жидкую питательную среду для выявления дифтерийного токсина вРНГА.3 день (48 часов)1. Учет результатов проб на токсигенность и на цистиназу,поставленных во второй день исследования. В случае наличияспецифических линий преципитации и при положительной пробе Пизувыдаютдокументированныйответ о выделении токсигенныхкоринебактерий дифтерии.2. Посев чистой культуры, выделенной во второй деньисследования, на среды Гисса для изучения биохимических свойств(сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).3. Повторный просмотр (через 48 часов) чашек первичного посевавизуально или с помощью МБС. Постановка проб на токсигенность,цистиназу и отсев колоний на скошенный сывороточный агар.4. В случае использования транспортной среды, ход исследованиясм. начиная с п. 1 второго дня и далее по схеме.5. Выдачабактериологическогоответаоботсутствиикоринебактерий дифтерии.6. При постановке РНГА для выявления дифтерийного токсина, приналичии положительного результата в этой реакции и обнаружении уисследуемой культуры фермента цистиназы, отсутствии ферментауреазы, можно выдать предварительный ответ о выделении возбудителядифтерии.4 день (72 часа)1. Учет токсигенных свойств культуры, выделенной в 3 деньисследования (через 48 часов роста первичного посева), и выдачадокументированного ответа о выделении токсигенных коринебактерийдифтерии. Посев выделенной культуры для определения биохимическихсвойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).2. Учет биохимических свойств культуры (токсигенной илинетоксигенной), выделенной во второй день исследования (через24 часа инкубации первичного посева).Выдача бактериологического ответа о выделении нетоксигенныхкоринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта идополнительного ответа о биохимических свойствах токсигенныхкоринебактерий дифтерии, выделенных ранее.5 день (96 часов)Выдача бактериологического ответа о выделении (через 48 часовинкубации первичного посева) токсигенных или нетоксигенныхкоринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта.4. Методики идентификации возбудителя дифтерийнойинфекцииОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННЫХ СВОЙСТВ КОРИНЕБАКТЕРИЙДИФТЕРИИ С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕВ основе метода определения токсигенности коринебактерийдифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузиитоксина и антитоксических антител в плотной питательной среде. Вместах оптимального количественного соотношения между токсином,продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным нафильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованиемпреципитата в виде белой линии или "усов".Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило,в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенногоагара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненныепостороннеймикрофлорой, также могут быть испытаны натоксигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов вагаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистымикультурами.Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь:стерильные чашки Петри с ровным дном, питательную среду - агарМартена или сухую коммерческую питательную среду, нормальнуюсыворотку крови крупного рогатого скота, стерильные полоски изфильтровальной бумаги размером 1,5 см x 8 см, очищенныйферментолизом и специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (вдальнейшем именуется антитоксин), противодифтерийнуюантитоксическую сыворотку лошадиную, лечебную (в дальнейшемименуется антитоксическая сыворотка), или готовые бумажные дискис нанесенным на них антитоксином, а также - контрольныйтоксигенный штамм коринебактерий дифтерии 24 - 48-часового роста.Приготовление чашек для постановки пробына токсигенностьПитательный агар для определения токсигенности целесообразноразливать в пробирки по 10 мл (количество, необходимое дляприготовления одной чашки). При большом объеме работы питательныйагар разливают во флаконы по 70 - 80 мл (на 7 - 8 чашек пробы натоксигенность). Питательный агар следует расплавливать только1 раз- многократное плавление ухудшает свойства среды. Питательныйагар расплавливают в водяной бане при 90ш C, тотчас же вынимают избани, охлаждают до 50ш C и добавляют 20% сыворотки крупногорогатого скота. Так, к 10 мл питательного агара добавляют 2 млсыворотки крупного рогатого скота, перемешивают и выливают,соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри, распределяютсоседу по дну осторожным вращением чашки.В центр чашки на поверхность застывающего агара обожженнымпинцетом помещают полоску из фильтровальной бумаги, пропитаннуюантитоксином (или антитоксической сывороткой).Чашку подсушивают в термостате при 37ш C в течение 15 -20 мин., повернув ее вверх дном. При использовании бумажныхиндикаторных дисков, чашку с питательным агаром подсушивают донанесения дисков на поверхность среды.Чашки со средой для определения токсигенности хранить нерекомендуется.Приготовление бумажных полосокПолоски фильтровальной бумаги нарезают размером 1,5 см x 8 см,заворачивают по 2 - 4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклавепри 0,5 атм в течение 30 мин. Пакетики с бумажными полоскамихранят в стерильной чашке Петри до 3 недель.Перед постановкой пробы на токсигенность содержимое ампулы сантитоксином растворяют в 1 мл стерильного физиологическогораствора, переносят в стерильную пробирку и указывают на нейданные этикетки (растворенный антитоксин хранят при температуре4 - 6ш C не более 10 дней). Фильтровальные бумажки обожженнымпинцетом помещают в стерильную чашку Петри. На каждую полоскунаносят 0,25 мл антитоксина, содержащего 500 ME в 1 мл. Дляудаления избытка сыворотки смоченную полоску прикладывают кстерильной крышке чашки Петри.При использовании антитоксической сыворотки(вместоантитоксина), требуется ее разведение до 500 ME в 1 мл.Разведение антитоксической сывороткиСоблюдая правила асептики, антитоксическую сыворотку переносятиз ампулы в стерильную пробирку. На пробирке указывают данныеэтикетки и срок хранения. Хранят сыворотку при температуре 4 -6ш C.Сыворотка должна быть разведена стерильным физиологическимраствором до содержания 500 ME в 1 мл. Коммерческий препарат можетиметь разную активность (5000 ME, 10000 ME, 20000 ME) и различныйобъем.Например, в ампуле содержится 10000 ME (в объеме 4,8 мл, какуказано на этикетке коробки с ампулами) антитоксической сыворотки.Для упрощения расчетов общий объем сыворотки можно принять за5 мл. Следовательно, в 1 мл сыворотки содержится 2000 ME(10000 ME: 5 = 2000 ME). Чтобы получить 500 ME в 1 мл, следует1 мл сыворотки развести в 4 раза, т.е. к 1 мл сыворотки добавить3 мл стерильного физиологического раствора. При необходимостиможно развести сыворотку в меньших объемах: к 0,1 мл сывороткидобавить 0,3 мл физиологического раствора или к 0,2 мл сывороткидобавить 0,6 мл физиологического раствора, или к 0,3 мл сывороткидобавить 0,9 мл физиологического раствора и т.д.Разведение сыворотки можно выполнить другим способом. Если,например, в ампуле содержится 5000 ME сыворотки в объеме 2,5 мл,то 500 ME содержится в 0,25 мл сыворотки. К этому объему добавляют0,75 мл стерильного физиологического раствора и получаютразведение сыворотки 500 ME в 1 мл.Разведенную сыворотку можно хранить до 7 дней при температуре4 - 6ш C.ПОСТАНОВКА ПРОБЫКультуру засевают в виде "бляшек" диаметром 0,6 - 0,7 см нарасстоянии 0,7 - 0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоскифильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более10 "бляшек". Из них 6 "бляшек" испытуемой культуры, 4 -контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемогоматериала засевают 6 контрольных "бляшек" и 4 - испытуемых(рис. 1 <*>). Чашки с посевом помещают в термостат при 37ш C.--------------------------------<*> Не приводится.Учет результатовРезультат учитывают через 18 - 24 часа и 48 часов роста.Следует иметь ввиду,чтопрепаратантитоксическойпротиводифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийномуантитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки.Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованиемданного препарата преципитаты могут образовываться не только врезультате связывания токсина с антитоксином (специфическиепреципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител скомпонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифическиепреципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, втом числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенныхкоринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественныхлиний преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило,слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48 -72 часа, в редких случаях могут появляться и на первые сутки.Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линийпреципитации испытуемого штамма со специфическими линиямиконтрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда уконтрольного штамма формируется несколько линий преципитации,специфическими следует считать более четкие и рано появляющиесяпреципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенностьосуществляют через 18 - 24 часа от момента ее постановки. Если втечение данного времени у контрольного штамма линии преципитациине обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условийпостановки реакции.Варианты оценки результатов реакции:1. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являютсятоксигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются илиимеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическимилиниями контрольного токсигенного штамма.2. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являютсянетоксигенными, если:а) линии преципитации, образуемые испытуемой культурой,отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации уконтрольного штамма-б) линии преципитации не могут слиться со специфическимилиниями преципитации контрольного штамма, а скрещиваются или имеюттенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифическиелинии)-в) линии преципитации испытуемой культуры сливаются снеспецифическими линиями контрольного штамма-г) линии преципитации испытуемой культуры перекрещиваются соспецифическими линиями и сливаются с неспецифическими линиямиконтрольного штамма.Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией антитоксин несодержит антител к компонентам микробной клетки. При использованииэтого препарата неспецифические линии преципитации не образуются.МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИГЕННЫХ СВОЙСТВКОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНДИКАТОРНЫХБУМАЖНЫХ ДИСКОВ С АНТИТОКСИНОМНа поверхность чашки Петри со средой для определениятоксигенности дифтерийных микробов помещают индикаторные диски сдифтерийным антитоксином. Вокруг каждого диска с антитоксиномформируют 5 "бляшек": две "бляшки" - контрольного штамма и три -испытуемые (из одного анализа с подозрительными колониямиформируют минимум две "бляшки" из изолированных колоний и одну -из смеси 3 - 6 однотипных колоний- материалом из этого же анализаможно занять места вокруг другого диска с антитоксином). Все пять"бляшек" располагают симметрично вокруг диска на расстоянии 0,8 смот его края. Диаметр каждой "бляшки" 0,8 см. На одной чашке Петриможно разместить до четырех дисков с антитоксином и,соответственно, до 20 "бляшек" с культурами. Чашки с посевамипомещают в термостат при 37ш C.Результат реакции учитывают через 18 - 24 часа, а также -через 48 часов. Наличие линий преципитации между диском сантитоксином и испытуемой культурой свидетельствует о еетоксигенности. Исследуемая культура считается токсичной, еслилиния преципитации данной культуры сливается под углом с линиейпреципитации контрольного штамма. Отсутствие линий преципитации уиспытуемых культур через 48 часов, при наличии их у контрольныхштаммов, указывает на отсутствие токсигенности у изучаемыхкультур. Линии преципитации у контрольных штаммов должныпоявляться через 18 - 24 часа. Более позднее появление линийпреципитации требует проверки качества питательной среды илизамены контрольного штамма.Хранение контрольного штамма в лабораторииДля хранения контрольного штамма в лаборатории можноиспользовать полужидкий сывороточный агар, приготовленный набульоне Мартена или другом питательном бульоне (pH 7,6). Хранить вхолодильнике, пересев один раз в 2 - 3 месяца. Полужидкий агарразливают по 8 мл в пробирки и добавляют по 1 мл сывороткикрупного рогатого скота.Контрольный токсигенныйштаммкоринебактерий дифтерии,варианта гравис получают в Государственном НИИ стандартизации иконтроля медицинских и биологических препаратовим.Л.А. Тарасевича. В пробе на токсигенность нельзя использовать, вкачестве контрольного, производственный штамм PW-8 и его варианты.Контрольный штамм необходимо периодически пассировать на кровяномагаре. Для успешной идентификации коринебактерий дифтерииконтрольный токсигенный штамм пересевается каждые 1 - 2 суток.МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИСТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (ПРОБА ПИЗУ)Коринебактерий дифтерии и коринебактерий ульцеранс, в отличиеот ложнодифтерийной палочки Гофмана и других коринеформныхбактерий, обладают ферментом цистиназой.Испытуемую культуру засевают петлей "уколом" в питательнуюсреду для определения цистиназы, разлитую в узкие пробиркистолбиком высотой 3 см. В составе питательной среды имеется цистини уксусно - кислый свинец. В процессе роста культура продуцируетцистиназу, расщепляющую цистин- а образующийся при этомсероводород вступает в реакцию с уксусно - кислым свинцом, которыйпревращается в серно - кислый свинец - соединение темно -коричневого цвета. Коринебактерий дифтерии и коринебактерийульцеранс вызывают не только почернение среды по ходу укола, но иобразуют вокруг него облачко темно - коричневого цвета нарасстоянии примерно 1 см от поверхности среды. Результат реакцииучитывают через 24 часа. При наличии множественного роста, дляполучения ускоренного ответа (через 3 часа), среду инокулируютбольшим количеством культуры. Одновременно с испытуемымикультурами, производится посев контрольного штамма в отдельнуюпробирку.ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИЛожнодифтерийные палочки Гофмана, коринебактерии ульцеранс инекоторые другие микроорганизмы рода Corynebacterium обладаютспособностью продуцировать в процессе роста фермент уреазу ирасщеплять мочевину. Коринебактерии дифтерии такой способностью необладают.Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах - по методуЗаксе (а) и путем посева на бульон с мочевиной (б).а) Для определения уреазы по методу Заксе extempore смешивают1 часть реактива А и 19 частей реактива В. Смесь разливают в узкиепробирки по 0,1 мл и вносят одну петлю испытуемой чистой культурысо скошенного агара или из пробирки со средой Пизу. Для выдачиускоренного ответа, при наличии множественного роста однотипныхколоний на чашке первичного посева, допускается внесениенескольких колоний в одну пробирку с пробой на уреазу. Результатучитывают после инкубации в термостате при 37ш C в течение 30 мин.б) Чистую культуру коринебактерий дифтерии засевают в бульон смочевиной, разлитый в пробирки по 2 - 3 мл и помещают в термостат,результат учитывают через 24 часа инкубации при 37ш C.Фермент уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака иуглекислоты. При этом повышается pH среды и происходит изменениецвета индикатора (покраснение). При отсутствии у исследуемойкультуры этого фермента, окрашивания среды не происходит.Рекомендуется одновременно, в отдельную пробирку, засеватьконтрольный штамм.ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИДля идентификации коринебактерий дифтерии используют такжеоценку сахаролитической активности выделенных культур на средахГисса с углеводами - сахарозой, глюкозой, растворимым крахмалом.Каждую пробирку со средой Гисса инокулируют 1 петлей чистойкультуры. Результат учитывают через 24 часа, а при отрицательномкрахмальном признаке - через 48 часов культивирования посевов втермостате при 37ш C.При сбраживании того или иного углевода образуется кислота,происходит восстановление обесцвеченного фуксина и средаприобретает малиновую окраску. Рекомендуется одновременно ставитьпробу с контрольным штаммом коринебактерий дифтерии вариантагравис.ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРАТРЕДУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТИСпособность коринебактерий дифтерии восстанавливать солиазотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты)является дополнительным признаком, позволяющим дифференцироватькоринебактерий ульцеранс.Производят посев исследуемой культуры в пробирку с нитратнымбульоном, инкубируют в течение 24 часов при температуре 37ш C.Затем добавляют 2 - 3 капли реактива на нитриты (Грисса илиКасаткина). В случае если произошло образование нитритов, средаокрашивается в красный цвет. Если микроорганизм не обладаетнитратредуктазой, изменения окраски среды не происходит.Одновременно с опытными пробирками, инкубируют контрольнуюпробирку со стерильной средой.5. Питательные средыКачество питательных сред имеет важнейшее значение при любомбактериологическом исследовании. Чтобы добиться максимальнойвысеваемости коринебактерий дифтерии из исследуемого материала,необходимо создать оптимальные условия для роста, размножения этихбактерий, сохранения их биологических свойств, а также дляингибирования роста сопутствующей микрофлоры. Это достигаетсяпутем использования универсальных питательных основ с добавлениемкрови и теллурита калия. Теллурит калия, в определеннойконцентрации,не препятствует росту представителей родакоринебактерий и практически полностью ингибирует рост постороннеймикрофлоры.Кровяныетеллуритовые среды являются такжедифференциально - диагностическими, поскольку колониикоринебактерий на этих средах имеют серую или черную окраску(данные микроорганизмы способны восстанавливать теллурит калия дометаллического теллура, вещества черного цвета, и накапливать еговнутри клеток).НПО "Питательные среды", г. Махачкала выпускает сухуюхинозольную дифференциально - диагностическую среду Бучина длявыделения коринебактерий дифтерии, которая готовится по прописи наэтикетке с добавлением 5% крови (не допускается добавлениесыворотки вместо крови). Среда Бучина уступает кровянымтеллуритовым средам по ингибирующей активности, а колониивозбудителя дифтерии могут появляться на сутки позднее, чем накровяных теллуритовых средах. В последние годы ГосНИИ прикладноймикробиологии (п. Оболенск Московской обл.) выпускает питательнуюсреду для выделения коринебактерий дифтерии - коринебакагар.Однако, по сравнению с кровяными теллуритовыми средами, на даннойсреде вырастает в 2 - 3 раза меньше колоний коринебактерийдифтерии.Учитывая вышеизложенное, по-прежнему, лучшими питательнымисредами для первичного посева материала являются кровяныетеллуритовые среды. В качестве основы для этих сред можноиспользовать сухой питательный агар (СПА) производства НПО"Питательные среды" (г. Махачкала), питательный агар на основепанкреатического гидролизата рыбной муки (ГРМ) производства ГНИИПМ(п. Оболенск). Питательные агары готовят по прописи на этикетке иextempore добавляют кровь и теллурит калия.Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтериивыпускается коммерческая сухая среда ОТДМ (НПО "Питательныесреды", г. Махачкала) и ГНИИПМ (п. Оболенск Московской обл.).Данные среды готовятся по прописи на этикетке.Лучшей основой при приготовлении среды для определениятоксигенности и пробы Пизу остается Мартеновский пептон, которыйготовится в условиях лаборатории или в отделах питательных среднекоторых научно - исследовательских институтов для приготовленияМартеновского агара.Для отсева колоний и культивирования коринебактерий дифтерии влабораторных условиях готовят сывороточную агаровую среду.Применение свернутой сыворотки является нецелесообразным.Каждая новая серия питательной среды (как коммерческой, так иприготовленной в лабораторных условиях) подлежитбактериологическому контролю. В тех случаях, когда ростовыесвойства питательной среды не удовлетворяют предъявляемымтребованиям, питательные агаровые основы готовят на бульонах -сухой питательный бульон (СПБ) производства НПО "Питательныесреды" (г. Махачкала),ГРМ-бульонпроизводстваГНИИПМ(п. Оболенск)- бульон на аминопептиде для микробиологических целейпроизводства мясокомбинатов (г. г. С.-Петербург, Армавир,Ставрополь) и бульонах, приготовленных в лабораторных условиях(перевар Хоттингера, 1% пептонная вода, с содержанием аминногоазота 150 - 180 мг/%).Питательные среды для первичного посева разливают по чашкамПетри слоем 3 - 4 мм. Они могут быть использованы в течение3 суток, при условии хранения при температуре 4ш C.МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И РЕАКТИВОВТРАНСПОРТНАЯ СРЕДА (СРЕДА НАКОПЛЕНИЯ)В качестве основы для приготовления транспортной средыиспользуют 0,1% питательный агар на переваре Хоттингера или 0,1%агар на коммерческом питательном бульоне, pH 7,6.0,1% агаровую основу разливают в пробирки по 4 мл, стерилизуютв автоклаве при 1 атм в течение 20 мин. Срок хранения - до1 месяца при 4ш C. Перед употреблением в каждую пробирку, ссоблюдением правил асептики, добавляют 0,5 - 1,0 мл сывороткикрупного рогатого скота и по 0,05 мл (1 капля) 2% растворателлурита калия. Среду выборочно контролируют на стерильность,выдерживая при 37ш C в течение 48 часов. Срок хранения готовойсреды - 10 дней при 4ш C.ЖИДКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РНГАС целью индикации дифтерийного токсина в РНГА материал с чашкипервичного посева засевают в пробирку с жидкой сывороточнойпитательной средой, приготовленной на основе бульона Мартена, ссодержанием аминного азота 150 - 180 мг/%, pH 7,6. Питательныйбульон разливают в пробирки по 3,5 мл, стерилизуют в автоклаве при1 атм. в течение 20 мин. Срок хранения - до 1 мес. при температуре4ш C.Перед употреблением в каждую пробирку с соблюдением правиласептики добавляют 0,5 мл сыворотки крупного рогатого скота и0,05 мл (1 капля) 2% раствора теллурита калия. Среду контролируютна стерильность и хранят так же, как и полужидкую транспортнуюсреду.СРЕДЫ ДЛЯ ПЕРВИЧНОГО ПОСЕВА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛАСреда Клауберга IIК 100 мл стерильной питательной агаровой основы (pH 7,6),расплавленной и охлажденной до 50ш C, добавляют 10 мл глицериновойсмеси, 50 мл "лаковой" крови и 3 мл 2% раствора теллурита калия.Принимая во внимание, что питательная среда разводитсяглицериновой смесью и "лаковой" кровью в 1,6 раза, приприготовлении данной среды следует увеличить навеску сухогопитательного агара, в 1,6 раза.Пример расчета. На этикетке флакона с сухим коммерческимпитательным агаром указана навеска, необходимая для приготовленияодного литра среды, например 30 г. Для приготовления 1 литрапитательной основы для среды Клауберга II следует взять навеску48 г (т.е. 30 г x 1,6 = 48 г).Для приготовления глицериновой смеси к 40 мл дефибринированнойкрови или кровяной смеси добавляют 20 мл химически чистогостерильного глицерина (глицерин стерилизуют при температуре 110ш Cв течение 30 мин.).Для приготовления "лаковой" крови к 34 мл стерильнойдистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови.КРОВЯНОЙ ТЕЛЛУРИТОВЫЙ АГАР (КТА)К 100 мл стерильной питательной агаровой основы (pH 7,6),расплавленной и охлажденной до 50ш C, добавляют 7 млдефибринированной или 10 мл гемолизированной крови и 2 мл 2%раствора теллурита калия. Вместо крови можно использовать сухуютеллуритовую смесь (11 мл на 100 мл среды), при этом, на 100 млКТА добавляют extempore 1 мл 2% раствора теллурита калия, т.к.1 мл 2% раствора уже содержится в 11 мл кровяной теллуритовойсмеси. Принимая во внимание, что питательная среда разводитсякровью примерно в 1,1 раза, при приготовлении данной среды следуетувеличить навеску сухого питательного агара в 1,1 раза.Пример расчета. На этикетке флакона с сухим коммерческимпитательным агаром указана навеска, необходимая для приготовленияодного литра среды, например, 30 г. Для приготовления 1 литрапитательной основы для КТА следует взять навеску 33 г (т.е. 30 г x1,1 = 33 г).МЕТОДИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ КРОВЯНЫХИ КРОВЯНО - ТЕЛЛУРИТОВЫХ СМЕСЕЙДля приготовления питательных сред лучше всего использоватьдефибрикированную кровь животных - крупного рогатого скота,лошадей, свиней, овец, кроликов. Кровь собирают в стерильныесосуды с бусами с помощью специально смонтированной системы,соблюдая правила асептики. В отдельных случаях кровь собирают, немонтируя специальных систем, сливая первые порции крови внебутыли.Можно использовать кровь человека с истекшим сроком годности(цитратную и с консервантами), приготовив из нее специальныекровяные смеси. Для этого необходимо удалить жидкую частьотстоявшейся крови, содержащую цитрат натрия и консерванты. Коставшейся в сосуде эритроцитарной массе добавить стерильныйфизиологический раствор, который также можно удалить послеоседания эритроцитов, и добавить дистиллированной воды допервоначального объема.Хорошим сырьемдляполучения кровяной смеси служитэритроцитарная масса, которая может оставаться при производствегаммаглобулина и других препаратов крови. К эритроцитарной масседобавляют стерильную дистиллированную воду из расчета 1/3 объемаэритроцитарной массы.Можно также использовать кровяные сгустки, остающиеся послесерологических реакций (при отрицательном результате реакции),сгустки плацентарной или абортной крови. Сгустки собирают встерильные бутыли со стеклянными бусами или битым стеклом, затемих замораживают и оттаивают, после чего сгустки легко разбиваютсябусами. Эту процедуру можно повторить 2 - 3 раза. Затем добавляютстерильную дистиллированную воду из расчета 1/4 объема сгустков.В кровяные смеси, приготовленные вышеуказанным способом,добавляют теллурит калия в качестве консерванта. К каждым 10 млкровяной смеси добавляют 1 мл 2% раствора теллурита калия. Такуюкровяно - теллуритовую смесь можно сохранять при 4ш C до2 месяцев.Пример расчета. Если из отстоявшейся цитратной крови объемом250 мл было удалено 50 - 60 мл жидкой части, то необходимодобавить такое же количество - 50 - 60 мл стерильногофизиологического раствора, перемешать, вновь дать отстояться,после чего удалить 50 - 60 мл жидкой части и внести 50 - 60 млстерильной дистиллированной воды. Таким образом, будет получено250 мл кровяной смеси. Для ее консервирования необходимо добавить25 мл 2% теллурита калия (на каждые 10 мл кровяной смесиприбавляют 1 мл 2% теллурита калия).В дальнейшем при приготовлении кровяной теллуритовой средына каждые 100 мл питательного агара добавляют 11 мл кровянойтеллуритовой смеси (10 мл кровяной смеси и 1 мл 2% растворателлурита калия). Extempore в такую среду добавляют еще 1 мл 2%раствора теллурита калия.Приготовление раствора теллурита калияДля теллуритовых сред используют готовый коммерческий2%-раствор теллурита калия.При отсутствии коммерческого препарата раствор теллурита калияготовят следующим образом: в 100 мл дистиллированной водырастворяют 2 г кристаллического теллурита калия. Для стерилизациираствор прогревают в кипящей водяной бане 30 мин. и сохраняют притемпературе 4шC. Кристаллический теллурит калия хранятгерметически закрытым в банке из темного стекла.СЫВОРОТОЧНЫЙ АГАРСывороточный агар, используемый для отсева колоний икультивирования коринебактерий дифтерии, может быть приготовлен налюбой из перечисленных выше питательных основ.К 100 мл расплавленного и охлажденного до температуры 50ш Cпитательного агара (pH 7,6) стерильно добавляют 10 мл сывороткикрупного рогатого скота. Среду перемешивают, разливают встерильные пробирки по 4 - 5 мл и устанавливают их в наклонномположении для получения скошенного агара, каждая партия которогопроверяется на стерильность. Несколько пробирок помещают на суткив термостат. В случае прорастания среды бракуется вся партия.Пробирки со скошенным сывороточным агаром хранят при 4ш C до2 недель.МАРТЕНОВСКИЙ АГАР С МЯСНОЙ ВОДОЙДВОЙНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИМартеновский пептон - 0,5 л, мясная вода - 0,5 л, агар -агар - 15 г, уксусно - кислый натрий - 5 г, мальтоза - 3 г.15 г агара промывают в течение рабочего дня в проточнойводопроводной воде, тщательно отжимают и переносят в 1 лмартеновского бульона (0,5 л мартеновского пептона и 0,5 л мяснойводы). Устанавливают pH 7,8 - 8,0 путем подщелачивания бульона20% раствором NaOH по бумажке с индикатором крезоловый красный,которая при этой реакции изменяет желтый цвет на розово -малиновый. Бульон кипятят в течение 10 мин. затем добавляют 0,5%(5 г на 1 л) уксусно - кислого натрия, 0,3% мальтозы (3 г на 1 л),проверяют pH и, если нужно, снова доводят до 7,8 - 8,0, кипятят втечение 15 мин., дают отстояться в теплом месте (в аппарате Кохаили термостате) 2 - 3 часа и фильтруют через тканевый или ватно -марлевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70 - 80 мл) прибольшом объеме работы или пробирки (10 мл) и стерилизуютоднократно текучим паром в течение 30 мин.Мартеновский пептонСвиные желудки, желательно парные, с упругими стенками,большим количеством слизи и без катаральных явлений очищают отжира (желудки, пропитанные желчью отбрасывают), разрезают иизмельчают в мясорубке. Полученный фарш из желудков помещают вбутыли емкостью 3 - 5 литров и заливают подогретой до 50ш C водойиз расчета на 1 литр воды 300 - 500 г измельченной массы. Туда жедобавляют 1% химически чистой соляной кислоты (уд. вес 1,19).Массу хорошо перемешивают и ставят в термостат: либо на 15 -18 часов (или более) при 37ш C- либо, при наличии отдельноготермостата при 42ш C, на 18 часов (или более). В течение процессаперевариваниябутыль встряхивают, вначале чаще (через 1 -1,5 часа), затем реже. В хорошо переваренном пептоне на дне бутылилежит небольшой слой мелкого темного осадка.Полноту осаждения балластных белков можно проверить путемдобавления к 5 мл профильтрованного пептона 1 - 2 капли 10% NaOH,муть не должна появляться.Действие фермента останавливают нагреванием в водяной бане,постепенно доводя температуру до 80ш C, устанавливаемую попоказанию термометра, погруженного в бутыль с переваром.Нагревание продолжается в течение 10 мин. Для этой цели можноиспользовать аппарат Коха или автоклав. Бутыли тщательновзбалтывают, закрывают ватно - марлевой пробкой с бумажнымколпачком и ставят в прохладное сухое помещение для отстаиванияпри температуре не выше 12ш C. Пептон годен к употреблению неранее, чем через 7 дней, когда плотно осядут взвешенные частицы.Необходимо добавить 20 мл хлороформа на 1 л пептона дляконсервирования и закрыть бутыль резиновой пробкой. В таком видепептон может храниться без стерилизации при комнатной температуре.Мясная водаДля приготовления мясной воды двойной концентрации желательноиспользовать свежее мясо молодого животного средней упитанности.Обезжиренное, освобожденное от сухожилий мясо пропускают черезмясорубку, заливают водой в пропорции 1 л воды на 1 кг фарша иоставляют на ночь при 4ш C, утром смесь кипятят на асбестовойсетке в течение 15 - 20 мин. с момента закипания. Готовый отварфильтруют, фарш отжимают, полученную мясную воду разливают встерильные бутыли по 250 - 500 мл и стерилизуют текучим паром3 дня подряд по 30 мин. Хранят при 4ш C.Бумажки с индикатором крезоловый красный0,1 г крезолового красного растворяют в 100 мл 95% спирта иоставляют при температуре 37ш C на 24 часа, часто встряхивая. Наследующий день смачивают в этом растворе полоски фильтровальнойбумаги и быстро высушивают. Ярко - желтый цвет бумажек в щелочнойсреде переходит в разные оттенки красного.СРЕДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИСТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИСреда Пизу на Мартеновском агареК 90 мл расплавленного 1,5% Мартеновского агара (недопускается использование агара Хоттингера), pH 7,6, добавляют2 мл 1%-раствора L-цистина в 0.1N растворе соляной кислоты (HCl),тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0.1N раствораNaOH для нейтрализации кислоты. Растворы кислот и щелочей должныбыть взаимно оттитрованы, можно использоватьфиксаналы,выпускаемые предприятиями химической промышленности.Среду стерилизуют при температуре 112ш C в течение 30 мин.,сохраняют в течение 1 месяца при 4ш C.Агар с цистином расплавляют при 90ш C (среду не кипятят - длясохранения цистина). К охлажденной до 45ш C среде добавляют 1 мл10% раствора уксуснокислого свинца и 9 мл сыворотки крупногорогатого скота, с соблюдением правил асептики, и разливают попробиркам.Необходимо учитывать, что при температуре среды 50ш C и выше,в присутствии уксуснокислого свинца, сыворотка мутнеет и средаприобретает молочный цвет. Это затрудняет учет результатовреакции.Среда Пизу на основе коммерческой среды АГВДля приготовления среды Пизу можно использовать доступную исбалансированную по составу коммерческую среду АГВ, применяемую вбактериологической практике для определения чувствительностимикроорганизмов к антибиотикам. Навеску сухой среды АГВ вколичестве 2,7 г вносят в 90 мл дистиллированной воды и кипятят доее полного растворения. Готовят 5% раствор гидрокарбоната натрия.Для этого растворяют 0,5 г NaHCO в 10 мл дистиллированной воды.Затем в раствор вносят 0,1 г L-цистина и кипятят до полногорастворения цистина. Затем 2 мл кипящего щелочного растворацистина вносят в 90 мл расплавленной среды АГВ, доводят pH до7,6 и стерилизуют при 112ш C в течение 10 мин. К расплавленной иохлажденной до 45ш C основе последовательно добавляют: 10 млсыворотки крупного рогатого скота, 1 мл 10% растворауксуснокислого свинца, 1,5 мл стерильного свежеприготовленного 10%раствора тиосульфата натрия и разливают по пробиркам.Растворы уксуснокислого свинца и тиосульфата натрия готовятextempore, используя стерильные пробирки и дистиллированную воду,стерилизуют текучим паром или на водяной бане в течение 30 мин.Данный вариантсреды Пизу используют при отсутствииМартеновского агара. Однаконеобходимоучитывать,чтодифференциально - диагностические свойства этой среды по сравнениюсо средой, приготовленной на Мартеновском агаре, менее выражены.СРЕДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИПробу на уреазу можно ставить в 2 вариантах: по методу Заксе ипутем посева на бульон с мочевиной.Приготовление реактивов для определенияуреазной активности по методу ЗаксеГотовят 2 реактива - А и В.Реактив А:Мочевина 2 г96% этиловый спирт 2 млДистиллированная вода 4 млРеактив В:0,2%-раствор фенолрот 1 млОднозамещенный фосфат калия (KH PO ) 0,1 г2 4Двузамещенный фосфат калия (K HPO ) 0,1 гХлорид натрия (NaCI) 2 40,5 гДистиллированная вода100 млРеактив А не стерилизуют и хранят при температуре 4ш C.Реактив В стерилизуют в автоклаве текучим паром.Бульон с мочевинойК 100 мл стерильного мясо - пептонного или бульона Хоттингера(pH 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствораиндикатора крезолрот. Разливают по 2 - 3 мл в стерильные пробиркии стерилизуют текучим паром в течение 10 мин.СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИДля определения сахаролитической активности рекомендуетсяиспользовать питательную среду на 1% пептонной воде.К 100 мл горячей дистиллированной воды добавляют 1 г пептона,0,5 г химически чистого NaCI и 1 мл индикатора Андреде.Устанавливают pH 7,4, кипятят 5 мин., фильтруют через бумажный илиполотняный фильтр, доводят до первоначального объема горячейдистиллированной водой. К полученной основе добавляют один изуглеводов: сахарозу, глюкозу (в количестве 1 г), крахмал (0,5 г).Среды разливают в пробирки по 2 - 3 мл и стерилизуют текучимпаром в течение 3 дней по 30 мин. или при 0,5 атм. 30 мин. Готовыесреды с индикатором Андреде бесцветные или имеют слегка розоватыйоттенок.Индикатор АндредеПосуда для приготовления индикатора должна быть сухой,химически чистой, с притертой пробкой.К 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г кислого фуксинаи 16,4 мл 4-процентного раствора NaOH. Раствор на сутки оставляютпри 37ш C, периодически встряхивая, двое суток выдерживают насвету и затем убирают в темное место. Свежеприготовленный растворимеет соломенно - желтый цвет или слегка розовый оттенок, которыйисчезает в процессе хранения. При интенсивно - розовой окраскераствора в процессе приготовления индикатора необходимо добавитьеще 1,6 мл 4-процентного раствора NaOH.СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРАТРЕДУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТИК 100 мл питательного бульона (МПБ или бульона Хоттингера)pH 7,3 - 7,5, свободному от нитритов (проверить реактивом Гриссаили Касаткина), прибавляют 0,1 г свободного от нитритов нитратакалия(KNO ). Проверяют еще раз на содержание нитритов и разливают по32 мл в химически чистые, сухие пробирки. Среды стерилизуют 15 мин.при 120ш C.Реактив ГриссаРаствор 1: 0,8% сульфаниловая кислота в 5N уксусной кислоте.Раствор 2: 0,6% диметил-альфа-нафталамин в 5N уксуснойкислоте.Перед выполнением реакции смешивают равные объемы растворов 1и 2. Реактив годен к применению в течение 15 мин., бесцветен, припоявлении розового окрашивания - непригоден. Растворы 1 и 2 хранятпри 4ш C в течение 2 мес.Реактив КасаткинаРаствор 1: 0,1% раствор риванола в дистиллированной воде.Раствор 2: 12% раствор соляной кислоты (HCI).Перед выполнением реакции смешивают равные объемы растворов 1и 2. Реактив годен к применению в течение 15 мин. Растворы 1 и 2хранят при 4ш C в течение 2 мес.РЕЦЕПТЫ КРАСОК1. Щелочной метиленовый синий Леффлера.Дистиллированная вода 99 мл1% раствор гидроксида калия (КОН) 1 мл10% спиртовой раствор метиленового синего 30 млСмешать. Окрашивать в течение 1 - 2 мин.2. Уксуснокислый толуидиновый синий.Толуидиновый синий 0,5 гЛедяная уксусная кислота2 мл96% этиловый спирт 5 млДистиллированная вода 100 млСмешать. Окрашивать в течение 3 - 5 мин.3. Кристаллический фиолетовый.Кристаллический фиолетовый 0,25 г5% раствор уксусной кислоты 100 млСмешать. Профильтровать. Окрашивать в течение 5 - 7 мин.МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДБактериологическому контролю подлежат среды для первичногопосеваматериала и среды для определения токсигенных,биохимических и сахаролитических свойств. При изготовлении средважным моментом является предварительный контроль основы среды насодержание аминного азота.МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИННОГО АЗОТАПринцип метода основан на блокировании формальдегидом при pH7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентногоколичества карбоксильных групп. Начало и конец титрованияопределяют потенциометрически.Реактивы:1. Гидроксид натрия (NaOH) 0,1N раствор.2. Соляная кислота (HCI) 0,1N раствор.4. Формалин (40% раствор формальдегида). Перед каждымопределением необходимо довести pH формалина до 7,0.Ход определенияДля анализа используют определенный объем жидкого образца. Дляжидких гидролизатов с низкой степенью расщепления (0,1 - 0,2%аминного азота) - 3 мл- со средней степенью расщепления (0,3 -0,6% аминного азота) - 1 мл- с высокой степенью расщепления (0,7 -1,3% аминного азота) - 0,5 мл- для жидких питательных сред (0,08 -0,04%аминного азота) - 3 мл- для жидких экстрактов (0,02 -0,04% аминного азота) - 10 мл.В стакан емкостью 50 мл вносят исследуемый образец и доводятобщий объем дистиллированной водой до 20 мл. Электродыпотенциометра погружают в исследуемый раствор и доводят pHраствора до 7,0 с помощью 0,1N раствора NaOH или 0,1N раствораHCl. Затем добавляют 2 мл нейтрального формалина, перемешивают и,не вынимая электродов, титруют содержимое пробы с помощью 0,1Nраствора NaOH до pH 9,1. При титровании следует использоватьмикробюретку на 5 мл.Содержание аминного азота в исследуемом образце в % (X)вычисляют по формуле:А x К x 1,4 x 100X = -----------------, гдеB x 1000А - количество 0,1N раствора NaOH в мл, пошедшее на титрованиеисследуемой пробы-К - поправка к титру 0,1N раствора NaOH-1,4 - количество аминного азота в мг, эквивалентное 1 мл 0,1Nраствора NaOH-100 - коэффициент пересчета в проценты-В - количество жидкого образца в мл, взятое на анализ-1000 - коэффициент пересчета мг в г.МЕТОД БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДВ практических лабораториях каждая партия питательных сред,особенно при использовании новых основ (промышленного илилабораторного изготовления) и новых ингредиентов, подлежитбактериологическому контролю ввиду возможной их нестандартности.1. Контроль качества сред для первичного посева исследуемогоматериала устанавливают путем определения:а) всхожести клеток коринебактерий дифтерии-б) времени формирования колоний-в) ингибирующейактивностив отношении сопутствующеймикрофлоры.С этой целью используют контрольный токсигенный штамм илисвежевыделенные токсигенные культуры коринебактерий дифтерии стипичными культурально - морфологическими свойствами, штаммзолотистого стафилококка (музейный или свежевыделенный).Суточные культуры коринебактерий дифтерии и стафилококка,выращенные на сывороточном агаре, смывают физиологическимраствором. Мутность полученной суспензии должна соответствовать10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича(условно 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл взвеси). Из исходныхвзвесей культур коринебактерий дифтерии и стафилококка готовятпоследовательные разведения вфизиологическомрастворе(см. схему).СХЕМАПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ КУЛЬТУРЫ КОРИНЕБАКТЕРИЙДИФТЕРИИ И СТАФИЛОКОККА+-----+-----------+---------------------------+------------------+| N | Кол-во | Объем вносимой | Условное кол-во ||про- | физиол. | суспензии, мл | микр. клеток ||бирки| р-ра, мл | | в 1 мл взвеси |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 8 || 1 |1,0| 1,0 из исходной взвеси| 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 7 || 2 |4,5| 0,5 из 1-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 6 || 3 |4,5| 0,5 из 2-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 5 || 4 |4,5| 0,5 из 3-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 4 || 5 |4,5| 0,5 из 4-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 3 || 6 |4,5| 0,5