Методики

Тестирование посуды и устройств для сбора биологических жидкостей (Нечипоренко, 1999)

Альготест для количественной оценки биологической активности химических соединений (Барашков, Киристаева, 1977)

Пробоподготовка для многоэлементного анализа по методическим указаниям Федерального центра Госсанэпиднадзора РФ МУК 4.1.1483-03

Пропись метода определения содержания свинца в цельной крови методом ИСП-МС с изотопным разбавлением (Paschal et al., 1995)

Методика многоэлементного анализа фракций крови

Определение сульфаниламидных соединений (метод Пребстинг и Гаврилова в модификации Тимофеевой для определения активности N-ацетилтрансферазы) (Першин, 1971)

Тестирование посуды и устройств для сбора биологических жидкостей (Нечипоренко, 1999)

Тестирование контейнеров (пробирки, флаконы), шприцев, систем типа «бабочка» (пластиковых игл и трубок).

1. Растворитель: Смесь 1% HNО₃ и 0,001% Тритона Х-100. Готовят на дистиллированной воде. 10 мл HNО₃ (хч) добавляют к 500 мл воды в чистой градуированной колбе 1 л. Затем добавляют 1 мл Тритона Х-100. После растворения объем смеси доводят до 1 л.

2. Для тестирования пластиковых шприцев, контейнеров, капиллярных трубок внутрь объекта вносят 1 мл растворителя и переносят его в аналитическую пробирку. В случае контейнеров раствор выдерживают внутри перевернутого на крышку или пробку сосуда в течение 12-14 час. В случае проверки металлических игл через них пропускают 1 мл раствора. Затем все аналиты по отдельности исследуют на содержание металлов.

3. Все расчеты производят на 1 мл раствора. Общее суммарное содержание металла во всех устройствах не должно превышать 5% эквивалента среднего расчетного уровня содержания металла в биологической пробе.

На описанный ниже альготест в 1977 г. получено авторское свидетельство № 557098. Хотя технически этот метод не очень сложен, требуется выполнить несколько условий, в частности, обеспечить наличие люминостата (непрерывное освещение люминесцентными лампами дневного света с интенсивностью 3700 эрг/см² сек, температура инкубации 29 ± 3° С) и иметь опыт работы с водорослями.

Тестовым организмом служит мезофильный штамм зеленых водорослей Chlorella pyrenoidosa 82 из коллекции каф. микробиологии МГУ. Его выращивают 3 суток при непрерывном освещении лампой накаливания с интенсивностью 1 10⁵ эрг/см² сек при 28°С в полной среде Тамия с мочевиной и добавленными микроэлементами в растворе Арнона-4.

Перед опытом клетки водорослей (в середине лаг-фазы роста) отделяют от среды центрифугированием (3 тыс.об/мин, 1200g, 5 мин), промывают 0,01% раствором NaCl и разбавленной в 5 раз средой Успенского-1 с рН около 7,0, полностью лишенной органических добавок.

Оптимальная концентрация клеток водорослей для максимальной чувствительности (5 10⁵ - 4 10⁶/мл) соответствует 15-40 единицам «силика-гелевого показателя» (СП), который равен массе суспензии тонкоизмельченного силикагеля КСК в мг/мл с такой же оптической плотностью при 578 нм, как и суспензия водорослей.

При оценке токсичности веществ или их смесей возможны варианты, связанные с растворимостью испытуемых веществ. Водорастворимые вещества вводят в суспензию в концентрациях, отличающихся на один порядок, например, 10, 1, 0,1, 0,01 мг/мл. Не растворимые в воде вещества вводят в сверхрастворителе, например, диметилсульфоксиде (ДМСО) или диметилформамиде (ДМФА). Концентрация сверхрастворителей не должна превышать 3% из-за свойственной им токсичности.

Приготовленные опытные и контрольные суспензии с одинаковым начальным СП₍₁ разливают по 20-25 мл или в широкогорлые колбы Эрленмей-ера (50-100 мл) или в стандартные пробирки в прозрачных штативах, закрывают ватными пробками и выдерживают в люминостате 85-95 час. Технически удобно и удовлетворительно для статистической обработки повторить каждый вариант 5-кратно.

После инкубации колбы (или пробирки) помещают в ванну УЗ-очистителя и облучают 10-15 сек ультразвуком мощностью 100 Вт для получения однородной суспензии. В них определяют СП опыта и контроля (СП_К) по оптической плотности при 578 нм (или число клеток). Расчеты проводят по формуле:

Процент изменения времени удвоения культуры

где %Т₂ — процент изменения времени удвоения культуры. Положительный результат свидетельствует о задержке роста и наличии токсического эффекта, отрицательный — о стимулирующем эффекте.

Критическую концентрацию (К_кр) находят графически. На оси ординат откладывают расчетные значения %Т₂ (выше 0 — положительные, ниже — отрицательные), а на оси абсцисс — концентрацию испытуемого вещества по логарифмической шкале. Место пересечения отрезка прямой между точками с большим и меньшим значениями %Т₂ с 5% уровнем, параллельным оси абсцисс, даёт величину К_кр- 5% уровень принят как критический в связи с тем, что ряд веществ не вызывают четкого стимулирующего эффекта, а снижение уровня ниже 5 увеличивает относительную ошибку определения.

Весьма удобным выражением результата является, помимо К_кр, расчет токсичности пробы относительно токсичности сульфата меди в «токсах» (Т_с), выявленной в той же серии опытов: Т_с = К^с_кр/К_кр. Выбор в качестве модельного стандарта токсичности CuSO₄ объясняется тем, что это вещество удовлетворяет двум требованиям: 1) оно наиболее широко распространено в качестве модельного токсиканта и 2) обеспечивает четкую величину К^с_кр при минимальной разнице между токсичной и стимулирующей концентрациями.

Примечание: Из явления избирательной токсичности следует, что универсальных тест-организмов не существует. Известные тесты, например, тест с дафниями, основаны на определении LD₅₀, что практически не позволяет установить критическую концентрацию испытуемого вещества, то есть такую, выше которой жизнедеятельность организма угнетается. Кроме того, тест-организм для опытов должен находиться в стандартном физиологическом состоянии в любое время года. Этому требованию лучше всего удовлетворяют одноклеточные зеленые водоросли.

Использование мезофильного штамма хлореллы позволяет увеличить чувствительность биотеста по сравнению с любым другим более чем на два порядка, очень простым способом. Предварительно штамм выращивают на полной среде с мочевиной, то есть мезотрофно. Затем клетки отмывают от среды и перемещают в бедные автотрофные условия, то есть подвергают двойному физиологическому шоку.

Необходимость введения внутреннего стандарта токсичности вытекает из невозможности проводить опыты в разное время года в одинаковых условиях. К^с_кр колеблется от опыта к опыту, но в большинстве случаев составляет около 3 мг CuSO₄/л.

Для пробоподготовки с помощью ИСП-МС следует использовать посуду из фторопласта, тщательно промытую в УЗ ванне разбавленной 1:1 HNО₃ и трижды ополоснутую деионизированной Н₂О.

Отбор, хранение и подготовка проб

Волосы состригают с затылочной части головы в количестве >0,1 г, обрабатывают ацетоном 10-15 мин, 3 раза промывают деионизированной Н₂О.

Ногти срезают с обеих рук и обрабатывают так же. Оба объекта хранят в бумажных конвертах.

Кровь из локтевой вены в количестве >1 мл хранят в холодильнике 3-5 суток, либо в морозильнике ( 18°С), либо лиофилизуют. Для длительного хранения образцы помещают в одноразовые полипропиленовые пробирки с герметичными крышками.

Аналогичным образом обрабатывают кровь при получении препаратов эритроцитарной массы, плазмы и сыворотки, а также пробы молока, спермы, лимфы, слюны.

Мочу (утреннюю или суточную) в количестве не менее 5 мл помещают в герметичной пластиковой посуде в холодильник до 3 суток или замораживают.

Биоптаты мышц, кожи, эпителия, печени и др. сразу же после получения взвешивают, помещают в герметичную пластиковую посуду и хранят в холодильнике 3-5 суток или замораживают.

Пробы зубов и костей помещают в герметичную упаковку из лабораторного пластика.

Препараты аминокислот, поливитаминов, БАВ и сырьё для их изготовления поступают в упаковке производителя. Минимальная масса твердых препаратов 10 г, жидких — 100 мл.

Открытое разложение проб

Волосы, ногти и др. твердые образцы. Навеску пробы помещают во фторопластовый цилиндр, добавляют 0,2-1,0 мл концентрированной HNO₃, накрывают защитной лабораторной пленкой и помещают в термоблок на 0,5-1,0 час при 115°С до полного растворения. Растворенный образец количественно переносят в мерную пробирку и доводят водными смывами до объема 10 мл, далее — на анализ.

Видео: Max OT. Методики тренировок

Жидкие образцы. Точную навеску образца (0,1-0,5 мл) помещают во фторопластовый цилиндр, определяя массу навески по разнице массы пробирки до и после получения навески. Добавляют 0,3-1,0 мл концентрированной HNO₃ и гомогенизируют пробу, как описано выше.

Для предотвращения осаждения белков и компенсации высокой вязкости образцов допускается простое разбавление пробы деионизированной водой с последующим подкислением с фактором разбавления не менее 1:100.

Микроволновое разложение

Точную навеску образца помещают во фторопластовый вкладыш, добавляют 5 мл HNO₃ и ставят в микроволновую печь. Разложение проводят по программе производителя (обычно 5 мин при 200"С), количественно переносят в пробирку и доводят до объема 10 мл водой. Отбирают 1 мл, доводят до объема 10 мл 0,5% HNО₃и анализируют.

Допускается непосредственный отбор аликвотной части разложенной пробы объёмом 0,1-0,5 мл. Для компенсации погрешности разбавления перед разложением в пробу вводят внутренний стандарт (In, Rh), чтобы его концентрация в конечном растворе аналита составляла примерно 10 мкг/л. Раствор внутреннего стандарта нужно добавлять во все холостые и калибровочные растворы.

Коррекция изобарных наложений, полиатомных наложений и транспортных помех

Помехи при отладке методики выявляют путем определения стандартных добавок и измерения серии последовательно разбавленных проб.

Коррекция изобарных наложений производится автоматически, в соответствие с программными пакетами приборов для ИСП-МС. Точные коэффициенты коррекции определяют экспериментально.

Коррекция полиатомных наложений требует внимания оператора для устранения помех. Приборы с реакционной ячейкой в принципе удаляют большинство полиатомных наложений. Конкретные способы для разных вариантов ручного удаления помех известны и приведены в соответствующих инструкциях к имеющемуся прибору.

Транспортные помехи корригируют путем максимально возможного разбавления и нормализации кислотного фона. Применение внутреннего стандарта позволяет устранить погрешности разбавления образцов и учесть многие матричные влияния на плазму и поток ионов.

Градуировка прибора, выполнение измерений, обработка результатов измерений и проведение внутреннего оперативного контроля описаны в соответствующих инструкциях к приборам. Производители приборов проводят соответствующее обучение операторов в рамках контрактов на поставку приборов.

Точно взвешивают две пробы цельной крови по 0,5 г. К одной добавляют около 100 мг раствора (около 100 мкл) из стандарта SRM 983, содержащего 92,15 ат.% ²⁰⁶Рb до конечной концентрации около 1 мг Pb/г. В обе аликвоты добавляют по 2 мл ультрачистой концентрированной HNO₃ и сжигают их в микроволновой печи во взвешенных фторопластовых сосудах.

Остатки охлаждают, переносят в 15 мл пробирки и разбавляют до 10 мл водой. Аликвоты анализируют с помощью ИСП-МС и определяют соотношение ²⁰⁸Рb/²⁰⁶Рb. Концентрацию Pb в оригинальной пробе рассчитывают по формуле:

Концентрация Pb

где [Pb] — концентрация Pb в неизвестной пробе в мкг/г,

К — соотношение относительной атомной массы натурального Pb к относительной атомной массе Pb в пробе с добавленным ²⁰⁶Рb (А_r = 206,063),

c_s — концентрация Pb в пробе с добавленным ²⁰⁶Рb в мкг/г,

m_sp — масса (г) добавленного раствора ²⁰⁶Рb,

m_sm — масса (г) оригинальной пробы,

0,0125 — относительное содержание ²⁰⁸Рb в пробе с добавленным SRM 983,

0.921497 — относительное содержание ²⁰⁶Рb в том же растворе,

208/206(s) — отношение в добавленном растворе,

А₂₀₆ и А₂₀₈ — природное содержание ²⁰⁶Рb и ²⁰⁸Рb в оригинальной пробе.

Методика многоэлементного анализа фракций крови

Для получения плазмы обычно в стандартную пластиковую пробирку с внесённым антикоагулянтом (гепарин-Na или -Li соли, К₂-ЭДТА = трилон Б, 9NC цитрат Na, оксалат К) получают образец крови. Клетки необходимо отделить максимально быстро с помощью центрифугирования, так как действие гепарина непродолжительно, а антикоагулянты значительно изменяют элементный состав сыворотки. При длительном хранении образцов крови в холодильнике в ней неизбежно происходят процессы гемолиза, а в морозильнике клетки крови разрушаются.

Для получения сыворотки образцу крови позволяют коагулировать («свернуться»), после чего отделяют сгусток фибрина вместе с клетками. Если требуется получить безбелковый фильтрат (ББФ), то к 1 части крови добавляют 9 частей 5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Белковый осадок удаляют центрифугированием (2 тыс. об/мин, 10 мин). Для определения элементов используют супернатант.

0,5 мл крови, или плазмы, или сыворотки помещают в сосуд микроволновой печи, добавляют 4,5 мл 30% HNO₃. Содержимое минерализуется (например, в микроволновой печи фирмы Berghof Speedwave™ MWS-2 по программе P₆ в 3-стадийном процессе (25 мин)).

Программа

Т₁

t₁

p₁

Т₂

t₂

p₂

Видео: Суперприседания. Методики тренировок

Т₃

t₃

Видео: Методика Зайцева | Методики раннего развития ребенка

p₃

Ткани, кровь

130°

8 мин

Видео: Методика Марии Монтессори | Методики раннего развития ребенка

80%

155°

5 мин

80%

170°

12 мин

80%

Минерализованный раствор разбавляют 5% HNO₃ до 10 мл (разбавление 20-крат) и используют для определения в ИСП-МС.

Примечание: В случае зашкаливания результатов по отдельным элементам аналит разбавляют. Все разбавления учитывают в окончательном протоколе результатов.

Определение сульфаниламидных соединений (метод Пребстинг и Гаврилова в модификации Тимофеевой для определения активности N-ацетилтрансферазы) (Першин, 1971)

Необходимые реактивы:

1) 15% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ)

2) 0,5% раствор NaNO₂

3) Насыщенный раствор CH₃COONa (1 часть соли растворяют в 2,8 частях H₂O)

4) 0,5% раствор ацетилированной H-кислоты (1,8-аминооксинафталин-3,6-дисульфокислота) (приготовленный в день проведения опыта)

5) 7-10% раствор НСl

6) Основной стандартный раствор

10 мг сульфадимезина или норсульфазола помещают в мерную колбу на 100 мл и добавляют 1-2 мл 0,1 N NaOH до полного растворения сульфаниламида. Доливают дистиллированную Н₂O до метки, то есть до концентрации препарата 100 мкг в 1 мл раствора. Раствор хранят в холодильнике.

Калибровочную кривую строят с помощью серии растворов взятого для исследования препарата для анализа на фотоэлектроколориметре (ФЭК) с синим фильтром, например, 10-8-6-4-2 мкг/мл.

Испытуемому дают 1-2 таблетки сульфаниламидного препарата, и собирают суточную мочу. В пробирку заливают 0,2 мл мочи, добавляют 2 мл раствора №1 + 1 мл раствора № 5 и 6,8 мл дистиллированной Н₂O. После перемешивания и фильтрования 1 мл фильтрата соответствует 0,02 мл мочи.

Анализ свободного сульфаниламида. В пробирку заливают 2,5 мл фильтрата мочи, приливают 0,1 мл раствора № 2, перемешивают и через 10 мин приливают 1,5 мл раствора № 3 и снова перемешивают. Сразу же добавляют 0,25 мл раствора № 4. После тщательного перемешивания появляется розовое окрашивание. Через 15 мин его интенсивность измеряют на ФЭК с синим фильтром.

Рабочие стандарты обрабатывают тате же. По калибровочной кривой вычисляют концентрацию свободного препарата с учетом всех разведений.

Анализ общего сульфаниламида. После приема часть препарата в организме обследуемого ацетилируется N-ацетилтрансферазой. Эту часть можно определить только после проведения гидролиза. В пробирку заливают 2,5 мл пробы и 0,25 мл раствора № 5. Подобным образом работают также со стандартными растворами. Пробирку со смесью помещают в кипящую водяную баню на 30 мин. После охлаждения объем жидкости в пробирке доводят до 2,5 мл дистиллированной Н₂O. Далее работают с раствором по методике определения свободного сульфаниламида.

По калибровочной кривой, построенной с растворами рабочего стандарта после гидролиза, вычисляют общее количество препарата (свободного и ацетилированного) в данной пробе. После вычитания количества свободного препарата получают количество ацетилированного препарата в %% по отношению к общему.

Медицинская бионеорганика. Г.К. Барашков