Медицинское законодательство: права, документы, обязанности, нормы, акты.

Приложение N 6УТВЕРЖДЕНОПриказ Минздрава Россииот 09.01.1998 г. N 2ИНСТРУКЦИЯПО УДАЛЕНИЮ ИЗ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУСАНТИТЕЛ ДРУГОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИОбщие сведенияВ практической работе по определению резус-принадлежностикрови наибольшее удобство представляет использование сыворотокантирезус группы крови АВ(IV), несодержащихгрупповыхагглютининов альфаибета.Такиесывороткиявляютсяуниверсальными, так как позволяют определять резус-принадлежностьв крови любой группы по системе АВО.Сыворотки антирезус, принадлежащие к группам О(I), А(II) иВ(III), также могут быть превращены в универсальные путемабсорбции или нейтрализации в них групповых агглютининов альфа ибета.Помимо групповыхагглютининовиспользованиюсывороткиантирезус мешают также имеющиеся в отдельных случаях изоиммунныеантитела другой специфичности, чаще всего анти-С и анти-Е. Еслиэти антитела имеют низкий титр, они могут быть удалены при помощиабсорбции или путем разведения сыворотки.Использование универсальных сывороток антирезус упрощаетработу, повышает эффективность лабораторной службы и исключаетполучение ошибочных результатов из-за несоответствия группысыворотки антирезус и исследуемых эритроцитов.Для освобождения сыворотки антирезус от агглютининов альфа,бета и от антител анти-С и анти-Е можно применять разные способы:а) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бетасоответствующим групповым веществом, содержащимся в амниотическойжидкости (см. п. 1)-б) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бетаестественным групповым веществом А и В (субстанция Витебского)(см. п. 2)-в) абсорбциюгрупповыхагглютининовальфаи бетарезус-отрицательными эритроцитами, находящимися в свертках кровипосле снятия с них сыворотки (см. п. 3)-г) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета путемразведения сыворотки (см. п. 4)-д) абсорбцию антител анти-С и анти-Е эритроцитами этойспецифичности (см. п. 5)-е) нейтрализацию антител анти-С и анти-Е путем разведениясыворотки (см. п. 6).1. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета при помощиамниотической жидкости<*>Амниотическая жидкость содержитраствореннуюгрупповуюсубстанцию, соответствующую группе крови плода. Она может бытьиспользована как в нативном виде, так и предварительно высушеннаяи затем растворенная дистиллированной водой (получение и обработкуамниотической жидкости см. п. 8).--------------------------------<*> - Амниотическая жидкость нейтрализует альфа и бетаантитела, относящиеся к классу lgМ, неполные альфа и бетаантитела, относящиеся к классу lgG, при этом не нейтрализуются.Для нейтрализации агглютининов альфа и бета в сывороткеантирезус группы Оальфа бета(I) используют амниотическую жидкостьгруппы АВ(IV) или смесь образцов амниотической жидкости группА(II) и В(III). Для нейтрализации агглютининов бета в сывороткегруппы Абета(II) используют амниотическую жидкость группы В(III).Для нейтрализации агглютининов альфа в сыворотке антирезус группыВальфа(III) используют амниотическую жидкость группы А(II).Для полного истощения групповых агглютининов в исходнойсыворотке антирезус проводят подбор оптимального соотношенияамниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки антирезус, длячего:- в штатив устанавливают пять пробирок с обозначениями 1:2,1:3, 1:4, 1:5, 1:6, во все пробирки вносят по 2 каплиамниотической жидкости - нативной или растворенной послевысушивания-- в первую пробирку добавляют 4 капли нейтрализуемойсыворотки, во вторую 6 капель, в третью - 8 капель, в четвертую -10 капель, в пятую - 12 капель-- содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 минут прикомнатной температуре-- после 10-минутной экспозиции смесь из каждой пробиркиконтролируют на плоскости наполноту нейтрализациисостандартными резус-отрицательными эритроцитами,содержащимиантиген, соответствующий нейтрализуемым агглютининам-- последнее разведение, в котором отсутствует агглютинация(время наблюдения 5 минут), принимается за оптимальное соотношениеамниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки-- если агглютинация отсутствует во всех разведениях, готовятразведения 1:7, 1:8, 1:9 и продолжают исследование, как сказановыше-- после того, как выбрано оптимальное соотношение, к основномуобъему сыворотки антирезус добавляют соответствующее количествоамниотической жидкости и перемешивают их. Через 10-20 минут послеперемешивания вновь проверяют сыворотку на полноту абсорбции наплоскости с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов группыА(II) и В(III)-- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с"Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагентаантирезус".Примечание:В целях упрощения получения универсальных сывороток изсывороток антирезус группы Абета(II) и Вальфа(III) их можнопредварительносмешивать,чтопозволяетнейтрализоватьодномоментно агглютинины альфа и бета амниотической жидкостьюгруппы АВ(IV) или смесью амниотической жидкости группы А(II) игруппыВ(III). Предварительное смешивание сывороткипротивоположных групп целесообразно еще и потому, что при этомпроисходитчастичнаявзаимнаянейтрализация групповыхагглютининов, что снижает количество амниотической жидкости,необходимое для полной нейтрализации, а, следовательно, снижаетсястепень разведения абсорбируемой сыворотки.Использование высушенной амниотической жидкостиПри низком титре сыворотки антирезус, ограничивающем ееразведение, для нейтрализацииагглютининовцелесообразноиспользовать сухой порошок. К нейтрализации приступают так же - сопределения оптимального соотношения сыворотки антирезус и сухогопорошка, полученного из амниотической жидкости, для чего:- в штатив устанавливают четыре пронумерованные пробирки, вкоторые вносят по 0,5 мл сыворотки антирезус-- в первую пробирку добавляют 2 мг высушенной амниотическойжидкости, во вторую - 4 мг, в третью - 8 мг и в четвертую - 16 мг.Содержимое пробирок перемешивают до полного растворения порошка иоставляют при комнатной температуре-- через 10 минут проводят испытание на плоскости на полнотунейтрализации с эритроцитами групп А(II) и В(III) и выбираютоптимальное соотношение ингредиентов-- выбранное соотношение используют для изготовления основногообъема сыворотки-- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".2. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бетаестественными групповыми веществами специфичности А и В(субстанция Витебского)Групповые специфическиевеществаАиВявляютсявысокомолекулярными полисахаридами, приготавливаются впроизводственных условиях из слизистой оболочки свиных и лошадиныхжелудков путем их ферментативного переваривания с последующимосаждением и очисткой органическими растворителями. Количествогруппового специфического вещества, необходимого для нейтрализацииантител в сыворотке, зависит от активности вещества. Длянейтрализации групповых агглютининов к сыворотке антирезусдобавляют групповое специфическое вещество из расчета:- к 1000 мл сыворотки антирезус группы О(I) - 0,1 г групповоговещества А и 0,1 г - группового вещества В-- к 1000 мл сыворотки антирезус группы А(II) - 0,1 ггруппового вещества В-к 1000 мл сыворотки антирезус группы В(III)- 0,1 г групповоговещества А.Для растворения группового вещества необходимое его количествосначала растирается стеклянной палочкой в пробирке или на часовомстекле с небольшим количеством (1 мл) сыворотки антирезус,подогретой до 37ш С, затем это групповое вещество переносят вобщее количество сыворотки антирезус, тщательно многократно смываяего сывороткой со стекла. Сыворотку антирезус перемешивают сгрупповым веществом и помещают в термостат на 3 часа, перемешиваякаждые 30 минут.После этого сыворотку помещают в холодильник при 4ш С неменее, чем на трое суток, а затем исследуют на пластинке насодержание групповых агглютининов с 6-8 образцамирезус-отрицательной крови группы А(II) и В(III).Отсутствие агглютинации означает, что групповые агглютининыполностью нейтрализованы. Наличие агглютинации означает неполнуюнейтрализацию групповыхагглютининов.Вслучае неполнойнейтрализации групповых агглютининов к сыворотке вновь добавляюттакое же или большее (до 0,5 г) количество группового вещества ився процедура повторяется.При полной нейтрализации групповых агглютининов сывороткуисследуют и обрабатывают далее в соответствии с "Инструкцией поизготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".3. Абсорбция групповых агглютининов резус-отрицательнымиэритроцитами на свертках крови группы АВ(IV)Неотмытые свертки крови группы АВ(IV), оставшиеся послеотсасывания сыворотки антирезус, допустимо хранить при 4-8ш С втечение 1-2 суток.Для абсорбции охлажденный сверток измельчают при помощистеклянной палочки и добавляют к нему также охлажденную сывороткуантирезус в количестве 1/6-1/3 объема по отношению к объему,занимаемому измельченным свертком (к 300 мл свертка приливают50-100 мл абсорбируемой сыворотки, в зависимости от активностигрупповых антител). Сыворотку, тщательно смешанную со свертком,оставляют на 18-20 часов при 4-8ш С, после чего отделяют отсвертка путем центрифугирования.Далее сыворотку проверяют на плоскости с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов и в случае полной абсорбции групповыхагглютининов обрабатывают и исследуют далее в соответствии с"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".4. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бетапри помощи разведения сывороткиДля нейтрализации сыворотку антирезус разводят изотоническимраствором NaCl специально подобранной сывороткой группы АВ(IV) илистандартным разводителем.Нейтрализация групповых антител при помощи разведения возможнатолько лишь при большом различии титра групповых и резус-антител.Например, если титр групповых антител 1:8, сыворотку следуетразвести не менее, чем в 16 раз, что возможно только в том случае,если титр резус-антител в ней после разведения сохранится не нижетребований, предъявляемых к стандартной сыворотке антирезус.В процессе работы в начале следует приготовить пробныеразведения сыворотки антирезус и исследовать титр резус-антител, атакже степень нейтрализации групповых антител с 6-8 образцамирезус-отрицательных эритроцитов группы А(II) и В(III).При сохранении достаточного титра резус-антител и полнотеабсорбции групповых антител разводят основной объем сывороткиантирезус и далее исследуют ее и обрабатывают в соответствии с"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".5. Удаление из сыворотки антирезус сопутствующих антителанти-С и анти-ЕЕсли на какой-либо стадии обработки сыворотки антирезус-Dвыяснится, что в ней содержатся еще и другие антитела антирезус,последние могут быть удалены путем абсорбции или разведениясыворотки.Абсорбция производится трижды отмытыми эритроцитами, взятымиприблизительно в половинном объеме по отношению к сыворотке. Еслив сыворотке имеется примесь антител анти-С, то для абсорбцииприменяются эритроциты фенотипа Ccddee, а если имеется примесьанти-Е, то эритроциты фенотипа ccddEe. Абсорбция проводится втечение 2-3 час. при температуре 37ш С при помешивании споследующей проверкой сыворотки на специфичность и активность.Если сопутствующие антитела не удалились, сорбцию можно повторить.Разведение сыворотки антирезус для удаления сопутствующихантител можно проводить при титре антител анти-D не ниже, чем1:128 - 1:256 и титре сопутствующих антител не выше 1:2.Сыворотку антирезус разводят изотоническим раствором NaCl,сывороткой - разводителем или стандартным разводителем.В начале следует сделать пробные порции, которые исследоватьна полноту нейтрализации сопутствующих антител и на сохранностьдостаточного титра резус-антител-D. При положительном результатеразводят основной объем сыворотки. Как после абсорбции, так ипосле разведения основного объема сыворотки ее вновь обрабатываюти исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлениюстандартных сывороток и реагента антирезус".6. Получение и обработка амниотической жидкости дляиспользования ее при изготовлении сывороток антирезусАмниотическую жидкость собирают в родильных домах от каждойроженицы отдельно в чистые флаконы. От одной роженицы может бытьполучено от 100 до 1500 мл. На этикетке флакона указывают фамилиюроженицы, дату взятия, количество и по возможности группу кровиноворожденного.Групповая принадлежность амниотической жидкости соответствуетгруппе крови новорожденного.Оплата засборамниотическойжидкостипроизводитсяучреждениями службы крови аналогично оплате за ретроплацентарнуюкровь из средств на заготовку крови.Подготовка амниотической жидкости к использованиюГрупповую принадлежность амниотической жидкости устанавливаютпутем определения групповой принадлежности крови новорожденногоили методомистощенияагглютининовальфаибета вгемагглютинирующей сыворотке группы О(I). Для этого в пробиркесмешивают равные объемы (по 1 мл) стандартной гемагглютинирующейсыворотки с титром 1:32 и испытуемой амниотической жидкости. Смесьперемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре.Затем смесь сыворотки и амниотической жидкости исследуют наплоскости со стандартными эритроцитами группы А(II) и В(III).Соотношение эритроцитов и смеси должно соответствовать примерно1:10, экспозиция 5-7 минут.Трактовка результатов- Наличие агглютинации в каплях с эритроцитами группы А(II) игруппы В(III) указывает на отсутствие в амниотической жидкостигрупповых антигенов А и В, т.е. на принадлежность ее к группеО(I). Такая амниотическая жидкость не пригодна для нейтрализациигрупповых агглютининов.- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы А(II)и наличие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III)указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе А(II).- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III)и наличие ее с эритроцитами группы А(II) указывает напринадлежность амниотической жидкости к группе В(III).- Отсутствие агглютинации в каплях как с эритроцитами группыА(II), так и группы В(III) указывает на принадлежностьамниотической жидкости к группе АВ(IV).Групповую принадлежность записывают на этикетке, которуюнаклеивают на флаконе с амниотической жидкостью.Контроль амниотической жидкости на специфичностьСледует учитывать возможность попадания в амниотическуюжидкость крови роженицы, в связи с чем необходимо исследоватькаждый образец амниотической жидкости на наличие групповыхагглютининов.Исследование амниотической жидкости с эритроцитами группыА(II) и В(III) проводится аналогично определению групповойпринадлежности крови.Наличие агглютинации означает наличие в амниотической жидкостигрупповых агглютининов крови роженицы. Такой образец непригодендля работы.Фильтрация и консервирование амниотической жидкостиПосле определения групповой принадлежности и контроля наспецифичность амниотическую жидкость фильтруют через обычныйбумажный фильтр или под вакуумом через фарфоровую воронку Бюхнера,в которую помещают измельченную фильтровальную бумагу толщиной5-7 мм. После фильтрования амниотическая жидкость становитсяпрозрачной.Консервирование производится борной кислотой из расчета 2 грна 100 мл или азидом натрия 1 г на 1000 мл.Срок хранения амниотической жидкости 12 месяцев при 4-8ш С.Высушивание амниотической жидкостиС целью удлинения срока годности амниотическую жидкостьвысушивают по 150-200 мл во флаконах емкостью 250-500 мл. Нафлаконы наклеивают этикетки с указанием группы амниотическойжидкости по системе АВО, ее исходного количества и датывысушивания.Высушенную амниотическую жидкость хранят при комнатнойтемпературе. Срок годности 5 лет. Высушенную амниотическуюжидкость перед употреблением разводят дистиллированной водой доисходного объема. После растворения используют аналогичнонативной.Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезусантител другойспецифичности", утвержденные Министерствомздравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/136, считатьутратившими силу с момента утверждения данной инструкции.Начальник Управленияорганизации медицинскойпомощи населениюМинздрава РФА.И.ВЯЛКОВПриложение N 7УТВЕРЖДЕНОПриказ Минздрава Россииот 09.01.1998 г. N 2ИНСТРУКЦИЯПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИI. ВВЕДЕНИЕОпределение резус-принадлежности заключается в выявлении вэритроцитах людей антигена D системы Резус.В систему Резус входят шесть антигенов: D, d, C, c, E, e,которые определяют с помощью соответствующих антисывороток.Антиген d серологически не выявляется. Существуют такжеразновидности антигенов резус: Du, Cw, cv, cx и другие.Антигены системы Резус встречаются со следующей частотой:D - 85%C - 70% c - 80%E - 30% e - 97,5%Антигены системы Резус обладают способностьювызыватьобразование изоиммунных антител.Наиболее активным в этом отношении является антиген D, которыйи подразумевается под термином резус-фактор. Именно по наличиюили отсутствию антигена D все люди делятся на резус-положительныхи резус-отрицательных.Различные сочетания антигенов резус в крови отдельных людейсоставляют 28 групп системы Резус (Табл. 1). В четырнадцати из нихсодержится антиген D - они являются резус-положительными, а другиечетырнадцать не содержат антигена D (нижняя часть таблицы) - ихотносят к резус-отрицательным.Таблица 1СИСТЕМА РЕЗУС+-----+------------------------------------------------------------+| N |Резус-положительные || +----------------------+-------------+----------+------------+| п/п | Фенотип | Частота в % | Генотип |Частота в % |+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 1-2 | CCDEE CwCDEe | 0,00 | ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 3 | ССDEe | 0,07 | CDE/CDe ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 4 | CcDEE | 0,035 | CDE/cdЕ |0,006 || | | | cDE/CdE |0,029 |+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 5 | CcDEe | 13,69 | CDe/cDE | 12,24|| | | | CDE/cDe |0,01|| | | | CDe/cdE |0,97|| | | | cDE/Cde |0,27|| | | | CDE/cde |0,19|| | | | cDE/cdE |0,006 |+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 6 | CwcDEe | 1,23 | ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 7 | ccDEe| 11,82 | cDE/cde | 10,04|| | | | cDE/cDe |0,72|| | | | cDe/cdE |0,06|+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 8 | ccDEE| 2,49 | cDE/cDE |2,16|| | | | cDE/cdE |0,33|+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 9 | CcDee| 31,93 | Cde/cde |29,90 || | | | CDe/cDe | 1,98 || | | | cDe/Cde | 0,05 |+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 10 | CwcDee |2,38 | ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 11 | CCDee| 16,81 | CDe/Cde |16,01 || | | | CDe/Cde | 0,80 |+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 12 | CwCDee |2,60 | ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 13 | CwCwDe |0,00 | ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 14 | ccDee|2,21 | сDe/cde | 2,10 || | | | cDe/cDe | 0,11 |+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| Резус-отрицательные |+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 15 | ccddee | 12,71 | cde/cde ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 16 | Ccddee |1,54 | Cde/cde ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 17 | CCddee |0,03 | Cde/Cde ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 18 | Cwcddee |0,035| Cwde/cde ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 19 | ccddEe |0,070| cde/cdE ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+| 20 | CcddEe |0,35 | Cde/cdE ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+|21-28| CwCddee CwCwddee | | ||| | ccddEECcddEE|0,00 | ||| | CCddEECCddEe| | ||| | CcddEeCwCddEe | | ||+-----+----------------------+-------------+----------+------------+II. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ1. Определение резус-принадлежности.Определение резус-принадлежности производится специалистом,имеющим специальную подготовку.Определение резус-принадлежностиреципиентов производитсястандартной сывороткой анти-D, что дает возможность разделить ихна резус-положительных (Rh+) и резус-отрицательных (rh-).В отличие от реципиентов определение резус-принадлежностикрови доноров производится в два этапа: сначала кровь доноровисследуется стандартной сывороткой анти-D, а затем кровь доноров,давшую отрицательную реакцию с сывороткой анти-D, исследуютдополнительно стандартными сыворотками антирезус, содержащимиантитела анти-С и анти-Е. Антитела анти-С и анти-Е могут быть всыворотке как в чистом виде, так и в сочетании с антителамианти-D, например: анти-D+C, анти-D+E или анти-D+C+E.В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица,кровь которых дает отрицательную реакцию со всеми сыворотками,т.е. не содержит ни одного из этих трех антигенов резус D, C, E.Иногда такие дополнительные исследования требуется проводить иу других лиц - у больных с подозрением на изосенсибилизацию и убеременных женщин.Результат определения резус-принадлежности крови доноровзаписывается в специальных листах или журнале и на лицевом листедонорского журнала (карточке) с указанием даты и за подписью лиц,производивших определение.Результат определения резус-принадлежности крови больных идругих лиц записывается в специальный журнал и на бланке суказанием даты и за подписью лиц, производивших определение. Этотбланк вклеивается в историю болезни и, кроме того, результат,указанный на этом бланке, записывается лечащим врачом в правомверхнем углу лицевого листа истории болезни и скрепляется егоподписью с указанием даты.2. Учет групповой принадлежности сыворотки антирезус.Сыворотки антирезусизготавливаютсяобычнов виде"универсальных", т.е. лишенных групповых антител анти-А и анти-В.Такие сыворотки пригодны для определения резус-принадлежностикрови людей любой группы по системе АВО.Однако, если изготовляются сыворотки антирезус различных групппосистеме АВО, то в этих случаях при определениирезус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичностьсыворотки. Сывороткой антирезус группы О(I) определяетсярезус-принадлежность только в эритроцитах группы О(I)- сывороткойантирезус группы А(II)- только в эритроцитах групп О(I) и А(II)-сывороткой антирезус группы В(III) - только в эритроцитах группО(I) и В(III)- сывороткой антирезус группы АВ(IV) и специальноприготовленной "универсальной" резус-принадлежность определяется вэритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы крови.3. Контрольные исследования.При каждом исследовании или проводимой серии исследованийнеобходимо для проверки специфичности и активности сывороткиантирезус ставить контроль. Для контроля применяются стандартныерезус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, чтои исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты.О стандартных эритроцитах см. "Инструкцию по взятию и учетукрови, получаемой от доноров малыми дозами для приготовлениястандартных эритроцитов".4. Особенности стандартных сывороток антирезус.Стандартные сыворотки для определения резус-принадлежностимогут содержать резус-антитела, разные по форме - полные инеполные (см. "Инструкцию по исследованию сыворотки на наличиерезус-антител"). Каждые из этих антител активны только в особыхусловиях, поэтому методика определения резус-принадлежностизависит от того, какие резус-антитела находятся в стандартнойсыворотке.Метод использования каждой стандартной сыворотки антирезусуказывается в сопроводительной инструкции.III. РАЗЛИЧНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИМетод определения резус-принадлежности зависит от формыантител в стандартной сыворотке и способа ее изготовления.При выдаче сыворотки антирезус к ней придается краткаясопроводительная инструкция с описанием того метода, для которогопредназначена данная серия выдаваемой сыворотки.1. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации сприменением желатина в пробирке с подогревом 46-48ш С.а) Специальное оснащение.Стандартная сыворотка антирезус анти-D с неполными антителами.Стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля.Центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл.Водяная баня 46-48ш С. Суховоздушный термостат 46-48ш С.10% раствор желатина. (Желатин можно сохранять с консервантом- сульфацилом натрия (альбуцид) - из расчета 100 мг альбуцида на10 мл 10% раствора желатина).Лупа с 2-4-кратным увеличением.б) Предварительная обработка испытуемой крови и стандартныхэритроцитов. Кровь для исследования следует брать в количестве5-8 мл в пробирку без стабилизатора. На пробирке надписатьфамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.Обычно после свертывания крови на дне пробирки остаетсянебольшое количество свободных эритроцитов, которые следуетупотреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно,следует встряхнуть сверток для отделения большего количестваэритроцитов.Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при температуре+4-8ш С.Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислогонатрия или другого стабилизатора (0,25 мл на 1 мл крови). В этомслучае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долитьдоверху изотонический раствор NaCl, содержимое ее перемешать ицентрифугировать. Отмытыеэритроцитыиспользоватьдляисследования.Непосредственно перед исследованием кровь может быть взята изместа укола пальца стеклянной палочкой и немедленно помещена впробирку с заранее введенной сывороткой антирезус, смешанной сжелатином 1:2.в) Техника определения. В штатив устанавливают два рядапробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду иподве пробирки для стандартных резус-положительных ирезус-отрицательных эритроцитов. На каждых двух пробиркахнадписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будетисследоваться. Пробирки нумеруют. В одинаково обозначенныепробирки (в два ряда) вводят по 1 капле (0,05 мл) исследуемыхэритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл)стандартных Rh+ и rh- эритроцитов.Во все пробирки первого ряда добавляют по одной капле (0,05мл) сыворотки антирезус.Во все пробирки (в два ряда) добавляют по две капли (0,1 мл)10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения.Второй ряд является контролем для исключения возможногонеспецифического склеиванияисследуемых эритроцитов (прямаяжелатиновая проба).Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив спробирками помещают в водяную баню при 46-48ш С на 15 минут или всуховоздушный термостат на 25-30 минут.При извлечении пробирок из водяной бани или термостатадоливают в них 5-8 мл изотонического раствора NaCl и перемешиваютсодержимое путем 1-2-кратного перевертывания пробирок.г) Трактовка результатов. Пробирки просматривают на светневооруженным глазом или через лупу.Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинацииэритроцитов.При положительном результате агглютинаты легко различимы ввиде красных комочков в прозрачной, почти обесцвеченной жидкости.При отрицательном результате в пробирке видна равномерноокрашенная в светло-красный цвет, опалесцирующая жидкость.Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,являются резус-положительными (Rh+). Образцы эритроцитов, недавшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательными(rh-). Однако результаты учитывают как истинные после проверкиконтрольных образцов, подтверждающих специфичность и активностьсыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации состандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группыи наличии агглютинации со стандартными резус-положительнымиэритроцитами одноименной группы или группы О(I). В пробиркахвторого (контрольного) ряда агглютинации быть не должно.Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда(прямая желатиновая проба положительная) говорит о неспецифичностиреакции. При этих условиях положительный результат с сывороткойантирезус не может быть учтен как истинный. В таких случаяхрекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изотоническимраствором NaCl для элюирования с них аутоантител и повторитьисследование. Присомнительном результате для определениярезус-принадлежности следует применить метод агглютинации всолевой среде с использованием сывороток антирезус, содержащихполные антитела.2. Определение резус-принадлежности при помощи стандартногоуниверсального реагента (в пробирках без подогрева).Специальное оснащение.стандартный универсальный реагент антирезус - анти-D-33% раствор полиглюкина-стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля-центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл-лупа с 2-4-кратным увеличением.Предварительная обработка исследуемой крови не требуется.Может быть использована кровь, взятая непосредственно передисследованием из места укола пальца, консервированная кровь иосадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови,взятой без стабилизатора.Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.Техника реакции.В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемыхобразцов эритроцитов в каждом ряду и по две пробирки длястандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которогоисследуется.Во все пробирки первого ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)стандартного универсального реагента антирезус.Во все пробирки второго (контрольного) ряда вводят по 2 капли(0,1 мл) изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33%раствора полиглюкина.В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласномаркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови. В пробирки,предназначенные для контроля, вводят стандартныерезус-положительные и резус-отрицательные эритроциты.Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затеммедленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтальногоположения так, чтобы содержимое растекалось по ее стенкам. Такоерастекание крови по стенкам пробирок делает реакцию болеевыраженной. Как правило, агглютинация наступает уже в течениепервой минуты, но для образования устойчивого комплексаантиген-антитело и четко выраженной реакции, а также в видувозможности замедленнойреакцииприслабовыраженнойагглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентомпри поворачивании пробирок проводят не менее 3 мин.Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического0,85% раствора NaCl и перемешивают содержимое 2-3-кратнымперевертыванием пробирок, не встряхивая.Трактовка результатов.Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или черезлупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинацииэритроцитов.При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьевиз склеенныхэритроцитов на фоне просветленной жидкостиисследуемую кровь считают резус-положительной(Rh+).Приотсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенноеокрашивание) исследуемую кровь следует считать резус-отрицательной(rh-). Однако эти результаты следует учитывать как истинные толькопосле проверки контрольных образцов, т.е. при положительнойреакции состандартнымирезус-положительными эритроцитами,отрицательной - с резус-отрицательными, а также после просмотрарезультатов во 2-ом контрольном ряду.Во всех пробирках 2-го контрольного ряда агглютинации быть недолжно.Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного рядауказывает нанеспецифическоесклеиваниеэритроцитови,следовательно, не позволяет учесть результат исследования какистинный.В этом случае рекомендуется отмыть исследуемые эритроцитытеплым изотоническим раствором NaCl для элюирования с нихаутоантител и повторить исследование.В сомнительных случаях для определения резус-принадлежностиследует применить метод агглютинации в солевой среде, используясыворотку с полными антителами.3. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации всывороточной среде на плоскости с подогревом.Специальное оснащение:стандартные сыворотки антирезус анти-D с неполными антителами-стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля-пластмассовые пластины-водяная баня 46-48ш С.Предварительная обработка исследуемой крови и стандартныхэритроцитов.Кровь для исследования берут в количестве 3-5 мл в обычныепробирки без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию,инициалы и группу крови лица, от которого берется кровь. Обычнопосле свертывания крови на дне пробирки остается небольшоеколичество эритроцитов, которые следует употреблять для реакции.Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнутьсверток для отделения большего количества эритроцитов.Эритроциты используют для исследования в виде 5-10% взвеси всобственной сыворотке. Взвесь готовят на глаз в этих же пробиркахпутем встряхивания содержимого.Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.Техника определения.На пластмассовую пластину у обозначений наносят по 1 большойкапле (0,1 мл) сыворотки антирезус в три ряда по горизонтали,всего в 6 точек (3 - одной серии сывороток и 3 - другой). Крометого, в одну точку наносят большую каплю (0,1 мл) стандартнойсыворотки группы АВ (IV), не содержащей резус-антител (контроль нанеспецифическую агглютинацию).К первой капле каждой серии сыворотки добавляют одну каплю(0,05 мл) взвеси исследуемых эритроцитов, ко второй капле каждойсерии - 1 каплю (0,05 мл) контрольных резус-положительных,одноименных с группой крови больного или группы О(I), и к третьейкапле каждойсерии1каплю(0,05мл)контрольныхрезус-отрицательных эритроцитов, обязательно одноименных с группойкрови больного по системе АВО. В контрольную каплю с сывороткойгруппы АВ (IV), не содержащей резус-антител, добавляют 1 каплю(0,05 мл) исследуемых эритроцитов. Капли перемешивают стекляннойпалочкой и пластину опускают в водяную баню при 46-48ш С на 10минут.Трактовка результатов.Результаты исследований просматривают при легком покачиваниипластины и трактуют по наличию или отсутствию агглютинацииэритроцитов.При положительном результате агглютинаты легко различимы напочти обесцвеченном фоне жидкости.При отрицательном результате капля остается равномерноокрашенной в красный цвет.Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,являются резус-положительными (Rh+).Образцы эритроцитов, не давшие агглютинацию с сывороткойанти-D, являютсярезус-отрицательными (rh-). Однако этирезультаты учитывают как истинные только при совпадении их в обеихсериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцовэритроцитов, подтверждающих специфичность и активность сывороткиантирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартнымирезус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличииагглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитамиодноименной группы или группы О(I), а также при отрицательномрезультате в контрольной капле с сывороткой группы АВ(IV), несодержащей резус-антител. Наличие агглютинации в этой каплеговорит о неспецифическом склеивании эритроцитов и, следовательно,положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтенкак истинный. В этих случаях резус-принадлежность следуетопределять, применяя другие методы исследования.4. Определение резус-принадлежности реакциейагглютинации в солевой средеСпециальное оснащение.стандартные сыворотки антирезус анти-D с полными антителами-стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля-пробирки высотой 1,5-2,0 см и диаметром 0,5-0,6 см с гладкимдном округлой формы или планшеты для иммунологических реакций суглублениями такой же конфигурации и объема-лупа с 2-4-кратным увеличением-термостат 37ш С.Предварительная обработка исследуемой крови и стандартныхэритроцитов.Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычныепробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического растворалимоннокислого натрия или другого стабилизатора. На пробиркенадписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от котороговзята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробиркидоливают доверху изотонический раствор NaCl, содержимое ихперемешивают и центрифугируют.Можно брать кровь без стабилизатора. При этом послесвертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количествосвободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следуетинтенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количестваэритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, каксказано выше.Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего 1каплю эритроцитовпереносят в соответственно обозначеннуюпробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NaCl.2% взвесь эритроцитов употребляют для исследования.Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.Техника определения.В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемыхобразцов эритроцитов в каждом ряду и две - для контролей.Предварительно штатив накрывают листом бумаги. На нем слегканакалывают отверстия, сквозь которые и устанавливают пробирки.Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию иинициалы лица, кровь которого будет исследоваться.Во все пробирки (лунка планшета) первого ряда вводят по 1капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки(лунки) второго ряда - по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезусдругой сериии во все пробирки (лунки) обоих рядов по 1 каплеизотонического раствора NaCl.В соответственно обозначенные пары пробирок (лунок планшета)добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси испытуемыхэритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвесиконтрольных (стандартных) резус-положительных ирезус-отрицательных эритроцитов.Содержимое тщательно перемешивают встряхиванием и помещают втермостат при 37ш С на 1 час. Можно затем оставить пробирки настоле при комнатной температуре еще на 1,5-2 часа до учетарезультата.За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдяв контакт с сывороткой антирезус.Трактовка результатов.Пробирки (планшеты) следует рассматривать по продольной осинад источником света, закрытым матовым стеклом.Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинацииэритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.При положительном результате осадок эритроцитов располагаетсяна дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость илизернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными,они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаяхэритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг болеесветлой центральной части.При отрицательном результате осадок эритроцитов располагаетсяравномерным слоем без шероховатостей и неровностей, иногда снебольшим просветлением в центре. Границы его представляют собойправильно очерченный круг.Диаметр осадка при отрицательном результате всегда меньше,чем при положительном.Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,являются резус-положительными (Rh+), образцы эритроцитов, недавшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательными(rh-).Однако результаты учитывают как истинные при совпадении их вобеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольныхобразцов, подтверждающих специфичность и активность сывороткиантирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартнымирезус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличииагглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитамиодноименной группы или группы О(I).Примечание. Полные антитела не выявляют слабый антиген Du.Повторное использование сыворотки.Послеопределениярезус-принадлежности из всех пробирок осторожно отсасываютсыворотку (эритроциты остаются на дне) и собирают ее в пробирку.Эту сыворотку можно повторно несколько раз применять дляопределения резус-принадлежности, пока активность ее не иссякнет,т.е. пока она будет давать четкую агглютинацию со стандартнымирезус-положительными эритроцитами и отрицательную реакцию - состандартными резус-отрицательными эритроцитами.IV. ОБЩИЕ ПРИМЕЧАНИЯ1. При определении резус-принадлежности независимо от методаопределения результат учитывается как истинный после проверкиконтрольных образцов, подтверждающих специфичность и активностькаждой серии сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинациисо стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименнойгруппы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительнымиэритроцитами одноименной группы или группы О(I) и в другихконтрольных пробах, применяемых для каждого метода.2. Если при определении резус-принадлежности наблюдаетсяслабая или сомнительная реакция, то следует повторно исследоватькровь данного лица другими сериями сывороток антирезус и другимиметодами, включая метод агглютинации в солевой среде ссыворотками, содержащими полные антитела.Если при этом все серии сывороток, содержащих неполныеантитела, дадут также слабую или сомнительную реакцию, а с полнымиантителами реакция будет отрицательная, это значит, что эритроцитысодержат слабую разновидность антигена резус, так называемыйантиген Du, частота которого около 1%. В этих случаяхрезус-принадлежность крови больного или беременной женщиныуказывают как резус-отрицательную (rh-), а резус-принадлежностькрови донора как резус-положительную (Rh+), не допуская такимобразом, переливания его крови резус-отрицательным реципиентам.V. ИССЛЕДОВАНИЕ ДРУГИХ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕЗУСПри использовании сывороток, содержащих антитела анти-С,анти-Е, анти-с, анти-е, анти-Сw в чистом виде, а также в сочетаниис анти-D, например D+C- D+E- D+C+E, применяются те же методы, чтои при использовании сыворотки антирезус анти-D. При этомучитывается форма антител.В качестве контролей используют эритроциты, содержащие и несодержащие соответствующий антиген."Инструкцию по определению резус-принадлежностикрови",утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990года N 05-14/29, считать утратившей силу с момента утвержденияданной инструкции.Начальник Управленияорганизации медицинскойпомощи населениюМинздрава РФА.И.ВЯЛКОВПриложение N 8УТВЕРЖДЕНОПриказ Минздрава Россииот 09.01.1998 г. N 2ИНСТРУКЦИЯПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИНА ПЛОСКОСТИ БЕЗ ПОДОГРЕВА И ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮСТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ И РЕАКТИВА АНТИРЕЗУС,ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЭТОЙ ЦЕЛИОбщие сведенияМетоды определения резус-принадлежности на плоскости безподогрева позволяют быстро проводить исследование без примененияособого лабораторного оборудования непосредственно у постелибольного, а также у доноров как в единичных случаях, так и примассовых обследованиях.Методы основаны на использовании сыворотокантирезус,изготовленных в сочетании с коллоидными растворами (альбумин,полиглюкин), в присутствии которых неполные резус-антителаприобретают способность агглютинироватьрезус-положительныеэритроциты на плоскости при комнатной температуре, аналогичнореакции по определению групп крови АВО.Наиболее удобными для практики являются методы определения наплоскости без подогрева при помощи сыворотки антирезус,изготовленной в сочетании с альбумином и при помощи реактиваантирезус, изготовленного из сыворотки антирезус в сочетании ссухим полиглюкином и альбумином.1. Определение резус-принадлежности на плоскостибез подогрева при помощи сыворотки антирезус,приготовленной с альбумином(прилагается при выдаче сыворотки)Оснащение:а) специально приготовленная универсальная сыворотка антирезусанти-D в комплекте с контрольной сывороткой-б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью-в) изотонический раствор NaCl-г) стеклянные палочки.Для исследования используют кровь, полученную непосредственноиз места укола пальца или взятую заранее в пробирку состабилизатором, но не более 2 суток хранения при 4-8ш С.Техника реакции.На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровькоторого исследуется, и, сделав соответствующие обозначения,наносят на нее в две точки: слева по 2 капли сыворотки антирезус исправа по 2 капли контрольной сыворотки. Рядом с этими капляминаносят по 1 капле исследуемой крови. Кровь тщательно смешивают ссывороткой стеклянной палочкой и размазывают на пластинке дополучения тонкого слоя. Затем пластинку периодически покачивают втечение 4-5 минут и добавляют в обе смеси по 1 каплеизотонического раствора NaCl для снятия возможной неспецифическойагглютинации. Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения5 минут, после чего учитывают результат.Трактовка результата.Если слева, то есть с сывороткой антирезус, произошлаагглютинация эритроцитов, а справа (контроль) ее нет - кровьостается равномерно окрашенной, без признаков агглютинации, этозначит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, чтоисследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).При наличии агглютинации в контрольной капле, что можетпроизойти при некоторых заболеваниях, например, засчетаутоантител, необходимо исследовать кровь повторно другимиметодами, желательно в лабораторных условиях.2. Определение резус-принадлежности при помощиреактива антирезус, изготовленного с использованиемсухого полиглюкина(прилагается при выдаче реактива)Оснащение:а) специально приготовленный реактив антирезус анти-D вкомплекте с контрольным реактивом-б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью-в) изотонический раствор NaCl-г) стеклянные палочки.Для исследования используют кровь, полученную непосредственноиз места укола пальца или взятую заранее в пробирку состабилизатором не более, чем за 2 суток до исследования. Кровьхранят при 4-8ш С.Техника реакции.На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровькоторого исследуется, и, сделав соответствующие обозначения,наносят на нее слева 1 каплю реактива антирезус и справа - 1 каплюконтрольного реактива, затем добавляют и к реактиву антирезус, и кконтрольному реактиву по 1 капле густой взвеси исследуемой крови.Кровь тщательно смешивают с реактивом и размазывают попластинке стеклянной палочкой тонким слоем. Затем пластинкупериодически покачивают в течение 3-4 минут и добавляют в обесмеси для исключения неспецифической агглютинации по 5-8 капельизотонического раствора NaCl.Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут,после чего учитывают результат.Трактовка результата.Если слева, т.е.с реактивом антирезус, произошлаагглютинация эритроцитов, а справа (в контроле) ее нет - этозначит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, чтоисследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).Однако результат учитывают как истинный только при отсутствииагглютинации в контроле.При наличии агглютинации в контроле, что может произойти принекоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, кровьнеобходимо исследовать повторно другими методами, желательно влабораторных условиях.3. Изготовление универсальной сыворотки антирезус анти-Dв сочетании с альбумином для определения резус-принадлежностина плоскости без подогреваСыворотка антирезус содержит неполные антитела анти-D.Выпускается в комплекте с контрольной сывороткой, не содержащейрезус-антител. Сыворотка предназначена для определениярезус-антигена D.Материалом для изготовления сыворотки антирезус в сочетании сальбумином служит сыворотка крови людей группы АВ(IV) илиспециально приготовленная - универсальная с титром неполныхрезус-антител анти-D не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса.Сыворотка должна быть предварительно исследована и признанагодной, как стандартная сыворотка антирезус в соответствии с"Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагентаантирезус".Материалом для изготовления контрольной сыворотки служитсыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая какрезус-антител, так и групповых агглютининов альфа и бета.Контрольная сыворотка должна соответствовать требованиям,предъявляемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткамсистемы АВО.При изготовлении сывороток антирезус в сочетании с альбуминомнеобходимы:- альбумин 20-30% раствор, полученный из плазмы кровичеловека-- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови,взятой на гепарине-- гепарин-- изотонический раствор NaCl.Работу по изготовлению сыворотки начинают сподбораоптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина. Подборможно вести двумя способами:а) используя одну и ту же сыворотку антирезус, испытывая с нейразные образцы (серии) альбумина, и выбирая таким образом образецальбумина с высокой конглютинационной активностью-б) используя один и тот же образец (серию) альбумина,испытывая его с разными образцами сыворотки антирезус.Выбор альбумина с высокой конглютинационной активностью.Сыворотку антирезус с титром неполных антител 1:64 - 1:128разводят в пробирках в 2-4 раза отдельно различными образцамираствора альбумина.Разные смеси сыворотки антирезус с альбумином исследуют напластинке с 5-6 образцами (Rh+) и с 5-6 образцами крови ccddee, атакже с кровью фенотипа Ccddee и ccddEe.Сыворотку антирезус, смешанную с альбумином, переносят в 2точки по 2 капли (0,1 мл) на пластинку, добавляют к ней по 1 капле(0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Каплиперемешивают и размазывают по пластинке до получения тонкого слоя.Наблюдение ведут до истечения 5 минут при покачивании пластинки.Учет и оценка результата.Результат учитывают по скорости наступления и величинеагглютинатов резус-положительныхэритроцитовиотсутствииагглютинации с резус-отрицательными эритроцитами. На основанииэтого отбирают образцы альбумина наиболее пригодныедляиспользования.Для последующего использования применяют образцы альбумина,при испытании которых агглютинация резус-положительных эритроцитовпоявляется в течение первых 20-30 секунд, а неспецифическаяаггрегация резус-отрицательныхэритроцитовотсутствуетдоистечения 10 минут.Подбор сыворотки антирезус с высокой конглютинационнойактивностью в альбуминовой средеНесколько различных образцов сыворотки антирезус наносятотдельно в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку и добавляют кним по капле (0,05 мл) 20-30% альбумина.Сыворотку тщательно смешивают с альбумином и добавляют к нейпо 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательнойкрови. Капли перемешивают с эритроцитами на плоскости до получениятонкого слоя. Наблюдение ведут до 5 минут при покачиваниипластинки.Так поступают отдельно для каждого испытуемого образцасыворотки, испытывая их с 5-6 образцами Rh+ крови и с 5-6образцами ccddee, а также с кровью фенотипа Сcddee и ccddEe.Учет и оценка результата.Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и еевыраженности с резус-положительными эритроцитами и по отсутствиюс резус-отрицательными эритроцитами ccddee и эритроцитами генотипаCcddee и ccddEe.Для последующего использования выбирают сыворотки антирезусанти-D, при испытании которых четко выраженная агглютинациярезус-положительных эритроцитов наступает в течение первых 20-30секунд, анеспецифическаяагглютинация резус-отрицательныхэритроцитов и эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe отсутствует доистечения 10 минут.Подбор оптимальногосоотношения сыворотки антирезус иальбумина.После выбора, альбумина с наиболее высокой конглютинирующейспособностью или, наоборот, выбора сыворотки антирезус с высокойагглютинирующей активностью в альбуминовой среде, приступают кподбору оптимального их соотношения, для чего:в штатив устанавливают 5 пронумерованных пробирок-в первую пробирку вносят 2 капли (0,1 мл) выбранной серииальбумина, во вторую пробирку - 4 капли, в третью - 6, в четвертую- 8 и в пятую - 10 капель-в каждую пробирку добавляют по 2 капли (0,1 мл) сывороткиантирезус и содержимое тщательно перемешивают-из каждой пробирки переносят в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) напластинку, образуя таким образом 2 ряда сыворотки с альбумином-во все капли 1-го ряда вносят по 1 капле (0,05 мл) свежейрезус-положительной крови, во 2-ой ряд - резус-отрицательной крови(кровь предварительно берут с гепарином - 1 капля на 10 мл крови).Смесь перемешивают и ведут наблюдение в течение 3 минут припокачивании пластинки.Учет и оценка результатов.Четкая агглютинация Rh+ эритроцитов и отсутствие агглютинацииrh- эритроцитов ccddee и эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEeуказывает на оптимальное соотношение данного образца сывороткиантирезус и альбумина.Приготовление основного объема (серии) сыворотки антирезусанти-D в сочетании с альбуминомДля приготовления полного объема (серии) стандартной сывороткииспользуют выбранныеоптимальныесоотношения сыворотки иальбумина. И сыворотку и альбумин используют тех же серий, которыеприменялись для установления оптимального их соотношения.К изготовленному полному объему смеси сыворотки с альбуминомдобавляют гепарин из расчета - 1 капля на 20 мл сыворотки.Приготовленную таким образом сыворотку проверяют на пластинкахс 5-6 образцами резус-положительных эритроцитов и с 5-6 образцамирезус-отрицательных ccddee, а также с эритроцитами фенотипа Сcddeeи ccddEe.При наличии четко выраженной агглютинации срезус-положительной кровью, наступающей через 30-40 сек, иотрицательной реакции с резус-отрицательной кровью ccddee и кровьюфенотипа Ccddee и ccddEe, сыворотку антирезус в сочетании сальбумином считают пригодной в качестве стандартной сывороткианти-D для определения резус-принадлежности на плоскости безподогрева.Исследование проводят с одновременным параллельнымиспользованием контрольной сыворотки.Изготовление контрольной сыворотки.Для изготовления контрольной сыворотки используютизогемагглютинирующую сыворотку группы АВ(IV) и добавляют к нейальбумин того же образца (серии) и в том же количестве и всоотношении, которые были использованы для приготовления даннойсерии сыворотки антирезус.Контрольную сыворотку испытывают аналогично тому, как описановыше для сыворотки антирезус. Контрольная сыворотка не должнавызывать агглютинацию эритроцитов.Консервирование сыворотки.Сыворотку антирезус и контрольную сыворотку консервируютборной кислотой из расчета 2 г. на 100 мл сыворотки.Розлив и паспортизация сыворотки антирезус иконтрольной сывороткиСыворотку антирезус разливают по 1-2 мл в ампулы, которыезапаивают, или во флаконы, которые плотно укупоривают резиновымипробками. На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указаниемучреждения, изготовившего сыворотку, специфичности сыворотки,метода, для которого она предназначена, количества, номера сериии срока годности.Контрольную сыворотку разливают, в таких же объемах и в том жеколичестве ампул (флаконов) и так же наклеивают этикетки. Номерсерии контрольной сыворотки повторяет номер серии основнойсыворотки антирезус.Хранение, срок годности и контроль.Сыворотки антирезус, изготовленные в сочетании с альбумином иконтрольные сыворотки хранят при 4-8ш С.Срок годности - 4 месяца.По истечении срока годности, но при сохранении активности испецифичности сывороток, срок годности может быть продлен еще на 1месяц.Выдача сыворотки антирезус.Сыворотка антирезус выдается в комплекте с контрольнойсывороткой.К каждому комплекту прилагают инструкцию по использованию.+-------------------------+ +-------------------------+| Наименование учреждения-| | Наименование учреждения-|| изготовителя | | изготовителя |+-------------------------+ +-------------------------+| Сыворотка антирезус-D | | Контрольная сыворотка || для метода на плоскости | | для метода на плоскости || без подогрева | | без подогрева || Для всех групп крови | | Для всех групп крови || системы АВО | | системы АВО || Серия ______ мл ______ | | Серия ______ мл ______ || Годна до __________ | | Годна до __________ |+-------------------------+ +-------------------------+Формы этикеток для сыворотки антирезус и контрольнойсыворотки.4. Изготовление реактива антирезус с использованиемсухого полиглюкина для определения резус принадлежностина плоскости без подогреваРеактив содержит неполные активные антитела антирезус анти-D,представляет собой вязкий опалесцирующий мутноватый раствор. Прихранении может выпадать осадок. Выпускается в комплекте сконтрольным реактивом, не содержащим резус-антител.Материалом для изготовления реактива антирезус служат нативныесыворотки крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленные- универсальные с титром неполных резус-антител не ниже 1:64 -1:128 внепрямойпробе Кумбса. Сыворотка должна бытьпредварительно исследована и признана годной, как стандартнаясыворотка антирезус.Материалом для изготовления контрольной сыворотки служитсыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая какрезус-антител, так и групповых антител альфа и бета. Контрольнаясыворотка должна соответствовать требованиям, предъявляемым кстандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.При изготовлении реактива антирезус необходимы:- полиглюкин, высушенный лиофильным способом-- альбумин-2,5% раствор-- изотонический раствор NaCl-- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови.Примечания:1. Полиглюкин высушивают лиофильным способом на сублимационномаппарате по регламенту, установленному для сушки плазмы. Сушкуведут во флаконах емкостью 250-500 мл.2. 2,5% раствор альбумина получают из готового 10%-20%раствора альбумина путем разведения его изотоническим растворомNaCl.Изготовление реактива антирезус.Сыворотку, содержащую антитела анти-D с титром не ниже чем1:64 - 1:128<*> переносят во флакон с предварительно высушеннымполиглюкином в объеме, равном количеству жидкого полиглюкина,высушенного в данном флаконе. В результате конечная концентрацияполиглюкина составит 6%.---------------------------------<*> - Примечание: сыворотку антирезус с более высоким титромможно развести до этого значения сывороткой группы АВ(IV),стандартным разводителем или 2,5% раствором альбуминавизотоническом растворе NaCl.Содержимое флакона тщательно перемешивают путем встряхиваниядо полного растворения порошка полиглюкина.Изготовление контрольного реактива.Для изготовления контрольного реактива в другой такой жефлакон с высушенным полиглюкином той же серии добавляютстандартный разводитель или 2,5% раствор альбумина так же доисходного объема полиглюкина. Содержимое тщательно перемешивают дополного растворения порошка полиглюкина.Исследование качества изготовленных реактивов.Исследование реактивов производят непосредственно после ихизготовления срезус-положительнымии резус-отрицательнымиэритроцитами и оценивают по характеру агглютинации и специфичностиреакции:на пластинку помещают два ряда, слева - по две капли (0,1 мл)реактива антирезус и справа - по две капли (0,1 мл) контрольногореактива-в первый ряд добавляют по одной капле (0,05мл)резус-положительных эритроцитов, во второй ряд также по однойкапле резус-отрицательныхэритроцитов.Содержимое капельперемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя иоставляют на три минуты периодически покачивая пластинку-через три минуты во все капли добавляют по 5-6 капельизотонического раствора NaCl, перемешивают и через две минутыучитывают результат.Реактивы исследуют не менеечемс20образцамирезус-положительных ис30 образцами резус-отрицательныхэритроцитов групп А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроцитыCcddee и ссddEe.Учет и оценка результатов.Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и еевыраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием еес резус-отрицательными эритроцитами (ccddee) и эритроцитамифенотипа Ccddee и rccddEe.Показателем пригодности реактива для последующегоиспользования является наличие крупнозернистой агглютинациирезус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1минуты и отсутствие ее с резус-отрицательными эритроцитами(ccddee) и эритроцитами фенотипа CcddEe и ссddEe.Контрольный реагент исследуется так же как описано выше дляреагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должнаотсутствовать со всеми образцами эритроцитов.Консервирование реактивов.Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борнойкислотой из расчета 2 г. на 100 мл реагента.Розлив и паспортизация.Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулызапаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками изавальцовывают или парафинируют.На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения,изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которогоон предназначен, количества,номера серии и срока годности.Контрольный реактив разливают в таких же объемах и в том жеколичестве ампул (флаконов), и также наклеивают этикетки ссоответствующим текстом. Номер серии контрольного реактиваповторяет номер серии основного реактива антирезус.+-------------------------+ +-------------------------+| Наименование учреждения-| | Наименование учреждения-|| изготовителя | | изготовителя |+-------------------------+ +-------------------------+| Реактив антирезус-D | | Контрольный реактив || для метода на плоскости | | для метода на плоскости || без подогрева | | без подогрева || Серия ______ мл ______ | | Серия ______ мл ______ || Годен до __________ | | Годен до __________ |+-------------------------+ +-------------------------+Хранение, срок годности и контроль.Реактив антирезус, приготовленный с сухим полиглюкином иконтрольный реактив хранят при 4-8ш С. Срок годности 4 месяца.Реактив антирезус и контрольный реактив проверяют наактивность и специфичность через месяц.Выдача реактива антирезус.Реактив антирезус выдается, в комплекте с контрольнымреактивом.К каждому комплекту (или набору комплектов) придаетсяинструкция по использованию."Инструкцию по определению резус-принадлежности крови наплоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки иреактива антирезус, предназначенных для этой цели", утвержденнуюМинистерством здравоохранения СССР 06 декабря 1990 года N05-14/38-14 считать утратившей силу с момента утверждения даннойинструкции.Начальник Управленияорганизации медицинскойпомощи населениюМинздрава РФА.И.ВЯЛКОВПриложение N 9УТВЕРЖДЕНОПриказ Минздрава Россииот 09.01.1998 г. N 2ИНСТРУКЦИЯ<*>ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНА АНТИ-DДИАГНОСТИЧЕСКОГО ЖИДКОГО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯD АНТИГЕНА СИСТЕМЫ РЕЗУС(АНТИТЕЛА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИ-D)ТУ 9398-215-27575295-95)1. НазначениеЦоликлон анти-D предназначен для выявления D антигена системырезус в эритроцитах человека и применяется в серологических тестахвзамен или параллельно с изоиммунной анти-D сывороткой.Порядок установления резус-принадлежности крови определен"Инструкцией по определениюрезус-принадлежностикрови",утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в1997 году и Методическими рекомендациями по определениюрезус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994года.--------------------------------<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директорТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.2. Характеристика и основные свойства Цоликлона анти-DДействующим началом Цоликлон анти-D являются моноклональныеанти-D антитела, продуцируемые лимфобластоианой линией клетокчеловека, полученной из лимфоцитов донора, гипериммунного против Dантигена. Антитела, продуцируемые клетками одного клона, являютсямоноклональными, принадлежат к одному классу иммуноглобулинов,полностью идентичны по структуре и биологической активности.Поскольку линия клеток, секретирующих моноклональные анти-Dантитела, получена из лимфоцитов здорового донора, исключенаконтаминация реагента патогенными вирусами (гепатит, СПИД и др.).Однако с исследуемыми образцами крови следует работать в перчаткахво избежание заражения патогенными вирусами, передающимися черезкровь.Цоликлон анти-D представляет собой неразбавленнуюилиразведенную солевым раствором культуральную жидкость,кондиционированную клетками-продуцентами антител. Анти-Dмоноклональные антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса G(IgGl). Цоликлон анти-D не содержит антител иной специфичности ипоэтому может быть использован для выявления D антигена вэритроцитах любой группы крови.Анти-D антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G(неполные антитела), не вызывают прямой агглютинации эритроцитов,содержащих D антиген, и могут быть использованы в реакцииконглютинации с желатином, непрямом антиглобулиновом тесте (пробеКумбса), вреакции агглютинации эритроцитов, обработанныхпротеолитическими ферментами, в том числе в автоматизированныхсистемах типа "Группоматик".3. Техника определения D-антигена системы резусОпределение D-антигенапроизводится в нативной крови,стабилизированной с помощью применяемых консервантов- в крови,взятой без консерванта- в крови, взятой из пальца. Наиболее четкаяреакция агглютинации наблюдается при использовании высокойконцентрации эритроцитов. Заключение о присутствии D-антигена висследуемых эритроцитах делают по наличию положительной реакцииагглютинации.3.1. Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса)Является наиболее чувствительным методом выявления D антигена.Взвесь (2-3%) в физиологическом растворе триждыотмытыхисследуемых эритроцитов помещают в круглодонную пробирку (0,1 млвзвеси эритроцитов) или 96-ячеечную круглодонную плату ((0,05мл/ячейку), добавляют равный объем Цоликлона и инкубируют втечение 45-60 минут при 37ш С. Затем после однократного отмыванияфизиологическим раствором к осадку эритроцитов добавляют 0,05-0,1мл антиглобулиновой сыворотки, тщательно перемешивают и немедленноили через 15-30 минут инкубации при комнатной температурецентрифугируют при 200 g в течение 15-20 секунд. Осадок мягковзвешивают и по наличию агглютинатов, выявляемыхмакро- илимикроскопически, делают заключение о присутствии D антигена висследуемых эритроцитах.3.2. Реакция конглютинации с желатиномВ агглютинационную пробирку вносят одну каплю (0,05-0,1 мл)свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся кровиилиэритроцитов, отмытых от консерванта. Затем добавляют две капли(0,1-0,2 мл) 10% раствора желатина, предварительно прогретого при45-50ш С до разжижения, и одну каплю Цоликлона анти-D. Суспензиютщательно перемешивают, инкубируют 10-15 минут в водяной бане или30 минут в термостате при 48ш С, прибавляют 5-6 млфизиологического раствора и после осторожного переворачиванияпробирки визуально определяют наличие агглютинатов. Агглютинация