Сельскохозяйственная биотехнология

Видео: Аэропонная установка, Институт сельскохозяйственных биотехнологий, Росбиотех - 2013

Убытки сельского и лесного хозяйства от насекомых-вредителей ежегодно исчисляются в мире около 100 млрд долларов. Долгое время для борьбы с ними использовались ядохимикаты, но, во-первых, они зачастую токсичны для животных и человека, а, во-вторых, ко многим ядохимикатам у насекомых развивается устойчивость. Все это привело к необходимости поиска новых эффективных средств борьбы.

Наиболее перспективным оказалось использование природных патогенов - микроорганизмов, чьи токсины являются причиной гибели насекомых-вредителей в их природных условиях. В настоящее время в различных странах мира производят более 30-ти микробиологических энтомопатогенных препаратов. Они характеризуются высокой специфичностью поражения определенных видов насекомых и практически полной безвредностью для человека, теплокровных животных, птиц и полезных насекомых.

Энтомопатогенные препараты, получаемые на основе микроорганизмов, выделенных из естественных условий и внесенных вновь в те же условия в виде патогенных препаратов, не вызывают нежелательных изменений в биоценозах и не нарушают экологического состояния в регионах.

Российская микробиологическая промышленность производит три группы энтомопатогенных препаратов:
1. Бактериальные препараты на основе Bacillus thuringiensis: энтобактерин, дендробациллин, инсектин, токсобактерин.
2. Грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria bassiana.
3. Препараты на основе вирусов ядерного полиэдроза: вирин-ЭНШ и вирин-ЭКС.

Все микробные патогены выпускают в виде смачивающихся порошков или паст, реже гранул, эмульсии и кристаллов.

При непосредственном применении чаще всего предполагают различные добавки в виде растворителей, эмульгаторов, способствующих повышению их эффективности.

Технология получения бактериальных энтомопатогенных препаратов

Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее широко применяется грамположительная бактерия Bac. thuringiensis, которая, помимо образования спор, вызывающих септицимию насекомого при попадании внутрь его тела, в ходе культивирования продуцирует ряд токсических соединений, повышающих эффективность приготовленных на ее основе препаратов.

Среди таких токсичных продуктов, вырабатываемых этой бактерией, выделяют четыре компонента:
1. a-экзотоксин (фосфолипаза С) - продукт растущих клеток бактерий. Он вызывает распад незаменимых фосфолипидов в тканях насекомого, что приводит к их гибели.

2. b-экзотоксин, или термостабильный токсин. Накапливается в культуральной жидкости симбатно росту клеток. Его действие связано с ингибированием действия ДНК-зависимой РНК-полимеразы, что приводит к прекращению синтеза РНК в клетках насекомых и к их гибели. Действие этого токсина довольно медленное.

3. 8-эндотоксин. Представляет собой кристаллический белок (имеет форму правильных кристаллов). Он не выделяется в культуральную среду, а остается внутри бактерии. Проявляет свое токсическое действие в желудочно-кишечном тракте насекомого, разрушая его ферментную систему.

Известно, что бактерии группы Bac. thuringiensis антагонистичны к 130-ти видам насекомых, среди которых вредители полевых, овощных, плодовых культур, виноградников и леса. Наибольший эффект достигается при применении данной группы препаратов по отношению к листогрызущим вредителям.

Способность Bac. thuringiensis образовывать различные токсичные продукты, споры, кристаллы используется в промышленности при производстве на основе этого микроорганизма широкого круга различных энтомопатогенных препаратов.

Все бактериальные энтомопатогенные препараты на основе Bac. thuringiensis производят по одной и той же технологической схеме. Технология производства включает все стадии, типичные для любого микробиологического производства, основанного на глубинном способе получения микроорганизмов: выращивание посевного материала в лаборатории и в посевном аппарате- промышленное культивирование в ферментаторе- концентрирование культуральной жидкости- сушку- стандартизацию и фасовку готового препарата.

Если посевной материал получают в виде спор, то на всех стадиях производственного культивирования используют питательную среду одного и того же состава. Как правило, это дрожже-полисахаридная среда, содержащая (в %): кормовые дрожжи - 2-3- кукурузную муку - 1-1,5- кашалотовый жир - 1. Если при выращивании посевного материала не предполагается доведение его до стадии образования спор, то в посевном аппарате применяют более концентрированные среды, чем в производственных ферментаторах.

Перед началом культивирования рН среды не регулируют: при добавлении всех компонентов она устанавливается обычно около 6,3. К концу ферментации рН повышается до 8-8,5. Процесс культивирования заканчивают при степени спорулизации 90-95 % и титре спор не менее 109 в 1 мл. Готовую культуральную жидкость перекачивают в отдельный простерилизованный сборник подкисляют до рН 6-6,2 и передают на стадию сепарации. В результате сепарации получают пасту влажностью 85 % с выходом около 100 кг в 1 м культуральной жидкости. Конечным продуктом производства может быть либо смачивающий порошок, либо стабилизированная паста.

Первый получают путем высушивания пасты на распылительной сушилке до остаточной влажности 10 % и смешением с каолином. Вторую - внесением в пасту карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). В этом варианте готовый продукт представляет собой вязкую жидкость светло-серого цвета, однородную по составу, не замерзающую при хранении, без запаха, не подвергающуюся гниению или брожению.

Технология получения грибных энтомопатогенных препаратов

Энтомопатогенные препараты на основе микроскопических грибов способны поражать большое количество насекомых-вредителей, вызывая у них заболевание - микоз. По сравнению с бактериями и вирусами грибы обладают рядом особенностей: а) поражение происходит не через пищеварительный тракт, а непосредственно через поверхностные ткани- б) насекомые поражаются в фазе развития куколки, что не наблюдается при воздействии на них микробных препаратов- в) грибы характеризуются относительно большой скоростью роста и огромной репродуктивной способностью- в виде спор могут длительное время находиться в природных условиях без заметного снижения энтомопатогенной активности.

Воздействие грибного препарата на насекомое начинается с проникновения споры гриба в полость его тела через кожные покровы. Попав в тело насекомого, грибная спора прорастает в гифу, затем разрастается в мицелий, от которого отчленяются гифальные тельца - конидии, составляющие инфекционную единицу энтомопатогенных грибов. Как правило, гибель наступает от большого количества токсинов, выделяющихся грибами.

Если же токсинов недостаточно либо насекомое не чувствительно к ним, гибель наступает после того, как нитевидный мицелий заполняет все тело насекомого, поражая, прежде всего, мышечную ткань. В зависимости от размеров насекомого гибель наступает в период от двух до восьми дней.

В России производится грибной препарат боверин на основе гриба рода Beauveria. Этот препарат применяют для уничтожения около 60-ти видов насекомых-вредителей, преимущественно жуков. Он безвреден для теплокровных животных и человека, не вызывает ожогов у растений.

Получают боверин с помощью как глубинного, так и поверхностного культивирования промышленного штамма гриба.
Получение боверина методом глубинного культивирования Получение боверина этим методом осуществляют в строго асептических условиях. В состав питательной среды входят следующие компоненты (в %): дрожжи кормовые - 2- крахмал - 1- хлорид натрия - 0,2- хлорид марганца - 0,01- хлорид кальция - 0,05.

Продолжительность культивирования составляет трое-четверо суток при температуре 25-28 С. Выращивание гриба проводят в условиях постоянного перемешивания и принудительной аэрации. В ходе глубинного культивирования гриба в течение первых суток-полтора кормовые дрожжи полностью лизируются, а гриб за это время проходит все фазы своего роста. К концу полного созревания гриба выделяется максимальное количество ферментов, что ведет к лизису мицелия и способствует накоплению конидий. Готовую культуральную жидкость подвергают сепарации или фильтрации.

После фильтрования получают пасту влажностью 70-80 %, которую направляют на распылительную сушилку. Высушенные споры представляют собой мелкодисперсный порошок влажностью 10 %. Полученный порошок стандартизуют необходимым количеством каолина, иногда в качестве добавок в готовый препарат вводят смачиватель и прилипатель.

Технология получения боверина методом поверхностного культивирования гриба

Этот способ более длителен и трудоемок, поэтому имеет ограниченное применение. Поверхностное культивирование гриба проводят как в жидкой питательной среде, так и на полутвердых, на этих средах гриб обладает хорошей скоростью роста. Его микробиологическое производство завершается на стадии получения спороносной пленки, которую впоследствии снимают, высушивают, измельчают и при необходимости стандартизуют соответствующим количеством наполнителя.

Среди возможных приемов, используемых в производстве боверина поверхностным культивированием, различают: а) культивирование гриба на жидких средах без автоклавирования, перемешивания и аэрации- б) культивирование на твердых автоклавированных средах без перемешивания и аэрации. Эти приемы основаны на том, что гриб хорошо растет на различных растительных субстратах - отходах сельскохозяйственной продукции.

Культивирование гриба на жидких средах без автоклавирования, перемешивания и аэрации проводят без предварительной стерилизации среды, ее просто нагревают до кипения, разливают в деревянные каркасы, покрытые изнутри полиэтиленовой пленкой. Среду, охлажденную до 30-40 С, засевают сухими спорами. Сверху каркасы накрывают полиэтиленовой пленкой, которую после образования спороносной пленки гриба снимают. В качестве сред используют всевозможные отвары, например: из сахарной свеклы, картофеля, тыквы, зерна, муки.

В процессе культивирования гриба на твердых автоклавированных средах без перемешивания и аэрации предусматривается стерилизация размещенных по отдельным емкостям питательных сред (сусло-агар, картофель, морковь, кукуруза, корки арбуза) в течение сорока минут при 110 С. В стерильный субстрат вносят сухие споры, емкости с субстратом встряхивают до однородного распределения посевного материала и оставляют стоять при температуре окружающего воздуха 18-23 С.

Образование конидиоспор завершается к концу 12-15 суток. Культуру гриба с остатками субстрата извлекают из емкостей и высушивают на стеллажах при 25-28 С. Получение готового препарата завершают размолом материала до мелкодисперсного порошка.

Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов

Из всех энтомопатогенных препаратов вирусные обладают наиболее высокой специфичностью по отношению к насекомому-хозяину: обычно они поражают только один вид, поэтому они практически полностью безвредны для флоры, фауны и человека.

Вирусы отличает высокая устойчивость к неблагоприятным воздействиям окружающей среды (температуры, влажности), они способны сохранять свою активность в течение 10-15 лет, находясь вне насекомого.

Заражение насекомого вирусом происходит при питании вредителя. Попавшие в кишечник вирионы проникают в клетки организма, и в ядрах этих клеток происходит репликация вирусов. Высвободившиеся вирусы поражают другие клетки до тех пор, пока насекомое не погибнет.

Отличительной особенностью производства вирусов является то, что они размножаются только в живой ткани. Поэтому производство любого вирусного препарата отличается от рассмотренных бактериальных препаратов.

Технология любого из вирусных препаратов начинается с разведения насекомого-хозяина на искусственных питательных средах, обеспечивающих их физиологически здоровое состояние. На определенной стадии развития (обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. При этом инокулят предварительно получают от нескольких больных личинок.

После выдержки, для максимального накопления вирусов в тканях насекомого (7-9 суток), собирают отмершие личинки, подсушивают их при 30-35 оС, измельчают механическим способа для вывода телец-включений из тканей. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, перемешивают и фильтруют (центрифугируют).

Готовые препараты изготовляют в виде водных растворов, масляных растворов, сухих порошков, паст и т. п.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик