Производство вторичных метаболитов: сушка, контроль и расфасовка препарата

После выделения и химической очистки антибиотика его необходимо высушить, т. е. удалить из препарата свободную и связанную воду. Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термолабильны, для их высушивания применяют методы, не приводящие к потере биологической активности, не изменяющие цвета препарата. На современном этапе промышленного получения антибиотиков используют следующие методы обезвоживания.

Это:
• Лиофильная сушка антибиотиков - широко распространенный метод, он проводится при сравнительно низких температурах (-8 - -12 С).

• Высушивание с применением распылительной сушилки - прогрессивный метод при работе с большими количествами антибиотика, раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибиотиков занимает несколько секунд, при этом даже термолабильные препараты не меняют свойств.

• Метод взвешенного слоя (или сушка в вакуум-сушильных шкафах) применяется для высушивания зернистых и пастообразных антибиотических препаратов.

Контроль препарата. Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому.
При биологическом контроле ставится задача выяснения стерильности готового препарата. Для этого обычно используют два метода.

Первый связан с инактивацией антибиотика и высевом его в соответствующую питательную среду. Например, биологический контроль бензилпенициллина и полусинтетических препаратов, полученных на его основе, проводится следующим образом. В пробирки, содержащие тиогликолевую среду, вносят фермент пенициллазу в количестве, способном полностью инактивировать пенициллин. Пробирки с пенициллазой выдерживают двое-трое суток при температуре 37 С для контроля стерильности фермента, затем в них вносят раствор пенициллина. Пробирки разделяют на две группы: одну выдерживают при 37 С, а другую - при 24 С в течение пяти суток. Ведут ежедневное наблюдение за возможным развитием микроорганизмов.

Второй метод выяснения стерильности антибиотиков определяется тем, что для большинства этих соединений не имеется инактиваторов их биологической активности. Поэтому у изучаемых препаратов выявляют устойчивые к ним формы микроорганизмов, а также определяют возможное присутствие чувствительной микрофлоры. Для определения возможного присутствия в таких препаратах чувствительной к ним микрофлоры раствор антибиотика пропускают через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,75 мк.

Фармакологический контроль. К антибиотическим веществам, используемых в медицинской практике, в соответствии с Государственной Фармакопеей предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическому применению, должен пройти всесторонние испытания на токсичность, пирогенность и другие свойства, жизненно важные для организма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности (влияние на кровь, ЦНС, дыхание и т. д.).

Показатели острой токсичности - один из критериев качества антибиотического вещества. Устанавливают максимально переносимую дозу (МПД) антибиотика- дозу, вызывающую гибель 50 % подопытных животных (LD50) и смертельную дозу (LD100). Только после всестороннего и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению.

Расфасовка и упаковка антибиотика - завершающий этап работы. Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу.

Обобщая весь многостадийный и многоступенчатый процесс получения антибиотика, можно отметить, что он включает в себя четыре основные стадии:
I стадия - получение соответствующего штамма, продуцента антибио-тика, пригодного для промышленного производства;
II стадия непосредственно связана с процессом биосинтеза антибиотика;
III стадия - это процессы выделения и очистки образовавшегося в ходе биосинтеза антибиотика;
IV стадия включает в себя операции, связанные с концентрацией антибиотика, его стабилизацией и получением готового продукта.

Биотехнологический процесс получения антибиотиков можно представить в виде следующей схемы (рис. 4.7).




Производство пенициллинов В 1871 г. В .А. Манасеиным было установлено, что зеленая плесень Penicillium glaucum при своем росте уничтожает бактерии, попадающие в культуральную среду. Это свойство Penicillium было тогда же использовано врачом А. Г. Полотебневым, применившим смоченные этой плесенью повязки при лечении гнойных ран и язв.

Выдающееся открытие русских ученых не получило широкой известности, и в 1928 г. англичанин Александр Флеминг вторично обнаружил способность плесневого грибка Penicillium угнетать рост микроорганизмов. Было показано, что вызываемая плесенью гибель микробов обусловлена образованием неизвестного органического вещества, названного пенициллином. Однако выделение пенициллина в чистом виде в то же время осуществлено не было, так как он оказался веществом очень лабильным, а применявшиеся методы очистки были несовершенны.

В годы Второй мировой войны огромная практическая потребность в эффективных антибактериальных препаратах привлекла к пенициллину внимание широкого круга специалистов, и примерно с 1939 г. начался период интенсивных исследований. Благодаря этому в относительно короткий срок (3-5 лет) англичанами Х. Флори и А. Чэттеном были разработаны способы промышленного получения и очистки пенициллина, изучены его лечебные свойства и методы клинического применения, а также установлена его химическая структура.

К пенициллинам относится группа близких по химическим свойствам соединений, содержащих в своей структуре b-лактамное и тиазолидиновые кольца:
R может иметь различные значения, в зависимости от типа пенициллина. Например, при R = -CH2C6H5 - это бензилпенициллин- R = -CH2-0-C6H5 - это феноксиметилпенициллин и т. д. Наличие карбоксильной группы придает молекуле пенициллина сильные кислотные свойства, поэтому пенициллин легко образует соли со щелочами (Na, K), а также с органическими основаниями, например с дибензилэтилендиамином (препарат - бициллин).

Для практических целей медицины пенициллин получают в промышленности путем биосинтеза. Процесс биосинтеза складывается из следующих стадий: 1) выращивания посевного материала (микроорганизмов) в аппаратах малой емкости - инокуляторах- 2) выращивания посевного материала в больших посевных аппаратах- 3) процесса ферментации- 4) выделения антибиотика из культуральной жидкости и его очистки.

Важное значение имеет также селекционный подбор высокопроизводительных штаммов плесени, подготовка и стерилизация питательной среды и аппаратуры.



Очень важное значение для высокого выхода пенициллина имеет питательная среда, примерный состав которой (в %) следующий:
Вместо какурузного настоя успешно применяется мука из хлопковых семян или мясные гидролизаты.

Приготовленную питательную среду подвергают стерилизации. Процесс ведут в колоннах непрерывного действия.

Далее питательная среда поступает в аппарат-выдерживатель, где охлаждается в течение определенного времени до температуры 23-25 С.

Первая стадия процесса - выращивание стандартной колонии штаммов плесени Penicillium chrysogenum - проводится в инокуляторах на питательной среде, где процесс идет ~30 часов. Подготовленный инокулят передают в посевной аппарат, объем которого ~ в 10 раз больше объема инокулятора. В посевном аппарате находится также стерилизованная питательная среда. Процесс роста здесь идет ~15-20 часов, и далее посевной материал передается на ферментацию в большие реакторы - ферментаторы объемом до 100 м на питательную среду. Процесс ферментации идет ~70 часов при температуре 23-24 С, рН среды 6-6,5 и постоянной аэрации воздуха - 1 л воздуха/1 литр питательной среды/1 мин по всему объему ферментатора.

Основная задача этого процесса - создание оптимальных условий для развития продуцента и накопления антибиотика.

Биосинтез антибиотика - двухфазный процесс. В течение первой фазы происходит быстрый рост и размножение мицелия или бактериальных клеток. Культуральная жидкость в этот период богата углеводами, азотом и неорганическим фосфором. Продукты обмена веществ микроорганизмов, в том числе и антибиотики, находятся в малых количествах.

Вторая фаза начинается с момента замедления роста культуры. Протекает она в культуральной жидкости, обогащенной продуктом жизнедеятельности организма с небольшим количеством углеводов и фосфора. В начале этой фазы мицелий обладает максимальной способностью к синтезу антибиотика. Фазы отличаются характером и интенсивностью биохимических реакций. С учетом этих различий подбирают условия, благоприятные для первой и второй фаз развития продуцента.

Для увеличения выхода антибиотика в питательную среду вводят «предшественники», т. е. химические вещества, способствующие целенаправленному синтезу антибиотика. Так, в питательную среду при биосинтезе пенициллина вводят «предшественник» фенилацетамид -это увеличивает выход антибиотика более чем в 2 раза.

По окончании процесса ферментации культуральную массу передают на процесс выделения антибиотика.

Большинство продуцентов при биосинтезе выделяют антибиотик в водную фазу, поэтому процесс выделения антибиотика начинается с разделения твердой и жидкой фаз.

Твердая фаза, кроме массы мицелия, содержит значительное количество коллоидных примесей, затрудняющих фильтрование, поэтому культуральную массу предварительно подвергают различным типам коагуляции (электролитической, тепловой, кислотной и т. д.). Наиболее эффективным методом коагуляции культуральной массы является ее обработка флокулянтами (высокомолекулярными полиэлектролитами), например, поли-(4-винил)-бензилтриметиламмонийхлоридом.

Оставшийся от фильтрации мицелия водный раствор антибиотика направляют на химическую очистку и выделение. Таким образом, водный раствор пенициллина направляют после фильтрации на экстракцию бутил-ацетатом при рН водной среды, равной 2. При таком значении кислотности среды подавляет кислотная ионизация пенициллина в водной фазе и он переходит в органическую фазу (в бутилацетат). Реэкстракцию пенициллина из бутилацетата проводят слабыми растворами щелочей.

Широко применяются сорбционные методы выделения и очистки антибиотиков. В качестве сорбентов широко используются синтетические ионообменные смолы.

Сушат пенициллины методом сублимации или распыления.

Угроза резистентности Успехи применения бензилпенициллина в лечении болезней, вызванных различными бактериями, были поистине сенсационными. Чувствительными к нему оказались и стафилококки, являющиеся возбудителями очень серьезных заболеваний.

Статистические данные показывают, что в 1944 г. число инфекционных больных, вылеченных бензил-пенициллином, было около 99,8 %, однако, уже в 1956 г. этот процент снизился до 65 %, особенно большой процент инфицированных больных, не поддававшихся лечению бензилпенициллином, наблюдался среди работников предприятий, производящих антибиотики, и работников хирургических клиник, широко использующих антибиотики для лечения больных.

Почему же именно эти заведения стали рассадниками болезнетворных организмов, устойчивых к действию пенициллина? Уже со времени первого применения пенициллина стало известно, что некоторые стафилококки невосприимчивы к нему. Чувствительные к пенициллину штаммы стафилококков погибают при лечении, остаются резистентные стафилококки, которые начинают размножаться и заполнять опустевшую нишу. И, таким образом, применение пенициллина для лечения заболеваний, вызванных резистентными формами стафилококка, не приведет к положительному результату.

Каким же путем избегают гибели стафилококки, резистентные к пенициллину? Было установлено, что они способны обезвредить молекулу пенициллина, изменив его структуру в самом слабом месте. Устойчивые стафилококки вырабатывают фермент, который может разрушить молекулу пенициллина при добавлении к ней молекулы воды. При этом процессе (гидролизе) образуется соединение, безвредное для микробов.

Фермент, способствующий реакции «обезвреживания», называется пенициллиназой. Его возникновение вызывается присутствием в среде пенициллина. С 1969 г. стала известна и химическая структура пенициллиназы, вырабатываемой стафилококками. В построении ее молекулы участвуют 257 структурных единиц двадцати аминокислот, соединенных в различной последовательности.

Другие бактерии образуют ферменты (ацилазы), которые разрывают связь между основным ядром молекулы бензилпеницилина и ее боковой ацильной группой, образуя биологически неактивную 6-аминопеницилановую кислоту
Второе расщепление ученые стали использовать для своих целей как возможность изменить молекулу пенициллина таким образом, чтобы ацилаза не смогла подвергнуть ее гидролизу. Таким способом были получены новые полусинтетические пенициллины.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик