Производство вторичных метаболитов: получение различных препаратов

Видео: Международный год природных волокон

Полусинтетический способ получения пенициллинов

В настоящее время большое значение имеет так называемый полусинтетический (биологический + химический) способ получения аналогов природного пенициллина, обладающих рядом ценных свойств. Исходным продуктом в синтезе служит 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК)
Кислоту получают в результате биосинтеза, при развитии штамма плесени Penicillium chrysogenum, в специфических условиях его культивирования (при отсутствии предшественников в среде) или чаще путем ферментативного дезацилирования бензилпенициллина с участием пенициллинацилазы. При этом образуется 6-АПК и фенилуксусная кислота.

Ацилированием аминогруппы 6-АПК получен ряд новых полусинтетических антибиотиков, которые кислотоустойчивы в желудке, не подвергаются деструкции в организме пенициллиназой, обладают более широким спектром действия:
В табл. 4.1 приведены наиболее полусинтетические пенициллины.

Химический синтез природного бензилпенициллина был проведен в 1957 г. Дж. Шееном с сотрудниками, однако он был многостадиен, давал низкий выход бензилпенициллина и поэтому не нашел практического применения.

Получение цефалоспоринов

Цефалоспорины относятся к группе Р-лактамных антибиотиков, близких по структуре к пенициллину. Основной продуцент этого антибиотика - гриб Cepholosporium acremonium:
Цефалоспорин подавляет развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, но антибиотическая активность гораздо ниже, чем у пенициллина. Структура Р-лактамного кольца его также неустойчива, и гидролизуется ферментом цефалоспориназой.

Полусинтетические аналоги цефалоспорина В последнее время методом смешанного (биологического и химического) синтеза получено большое число аналогов цефалоспорина. Многие из этих соединений имеют важное практическое значение.

Основой полусинтеза цефалоспоринов служит 7-амино-цефалоспорановая кислота, которая получается в результате отщепления ацильного остатка от цефалоспорина С под действием фермента ацилазы. Модификация основного ядра цефалоспорина может происходить с двух сторон молекулы:
Химическим или биотехнологическим (ферментативным) путем можно отщепить правую ацетоксигруппу (-ОСОСН3) 7-аминоцефалоспорановой кислоты с образованием 7-аминодеацетоксицефалоспорановой кислоты и на ее основе синтезировать полусинтетические антибиотики, широко применяемые в медицинской практике.

Общая формула полусинтетических цефалоспоринов
В табл. 4.2 приведены некоторые медицинские препараты, полученные на основе полусинтетических цефалоспоринов.


Модификация молекулы цефалоспорина приводит к существенным изменениям антимикробных свойств: расширению спектра антимикробного действия, увеличению устойчивости антибиотиков к лактама-зам, повышению липофильных свойств веществ, что дает возможность использовать их в таблетках.

Получение стрептомицина Ярко выраженной способностью вырабатывать антибиотические вещества обладают, помимо плесеней и микробов, также и лучистые грибки - актиномицеты, обычно обитающие в почве. Сравнительно быстрая гибель большинства патогенных микробов при попадании в почву тесно связана с явлением антагонизма актиномицетов и бактерий.



Изучение этого явления привело к открытию в 1943 г. С. Ваксманом второго после пенициллина антибиотика - стрептомицина, устойчивого не только к грамположительным, но и к грамотрицательным, и кислотостойким бактериям:
В этом смысле он превосходит пенициллин, который почти не активен к последним двум группам возбудителей инфекции. Особенно важным свойством стрептомицина является его высокая активность к возбудителю туберкулеза.

В своей структуре стрептомицин содержит (а) N-метил-Б-глюкозамин, (б) - стрептозу и (в) - стрептидин и является сильным органическим основанием. В практике применяют его соли с кислотами (соляной, серной и др.)

При культивировании стрептомицина в качестве источника энергии требуется быстро метаболизируемый сахар (например, глюкоза), который вводят в начале процесса. Однако скорость его ассимиляции должна быть строго ограничена количеством присутствующего азота и фосфата, что в противном случае приводит к чрезмерному росту мицелия и снижению выхода антибиотика.

На практике азот вводится в виде сложных соединений (фильтрат барды и остатки масличного семени), которые в течение длительного процесса ферментации медленно разлагаются, выделяя аммиачный азот, рН среды 7,0-8,0, температура ферментации ~28,5 С. На стрептомицин не действует ни пенницилаза, ни большинство микроорганизмов- если на более поздних стадиях процесса происходит инфицирование культуры, то образовавшийся стрептомицин не разрушается.

Типичные промышленные среды представляют смеси 2,5 %-й глюкозы, 4 %-й соевой муки с низким содержанием масла, 0,5 %-й барды и 0,25 %-й поваренной соли- в некоторых случаях добавляют сухие дрожжи, мясные экстракты и кукурузный экстракт. В процессе ферментации могут использоваться масла и жирные кислоты (в качестве питательных компонентов либо в качестве пеногасителей). Процесс ферментации развивается так же, как и в случае производства пенициллина, причем образование стрептомицина в течение первых трех дней не происходит. За 6 дней концентрация стрептомицина достигает конечной величины - 0,8 %.

Поскольку мицелий получается гораздо более мелкий, его нельзя собрать на волокнистом фильтре, поэтому для осветления субстрата используют кизельгур, в результате чего отфильтрованная масса делается пригодной для скармливания скоту. Субстрат разделяют на ионообменной колонне.

Получение тетрациклинов

В 1948 г. из почвы был выделен новый вид актиномицета -Streptomyces aureofaciens, образующий антибиотики - хлортетрациклин, тетрациклин и другие вещества:


Как было найдено, эти антибиотики обладают широким антибиотическим действием в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, риккетсий, спирохет, хламидий и т. д. Их применяют в сельском хозяйстве как стимуляторы роста животных и птиц.

Хлортетрациклин был первым из выделенных тетрациклинов. В зависимости от свойств штамма в качестве источника энергии могут быть использованы различные углеводы, однако для промышленного производства представляют интерес лишь сахароза, крахмал и глюкоза. Максимальные выходы антибиотика достигаются в результате ограничения содержания неорганического азота в среде и заменой его сложными веществами биологического происхождения (мукой масличных семян, арахисом, копрой - ядром кокосового ореха).

В среду во многих случаях добавляют кровяную муку, рыбную муку и гидролизованный казеин. В ограниченных концентрациях используют кукурузный экстракт и барду при определенном содержании фосфатов. Содержание фосфатов является важным фактором, поскольку пока весь неорганический фосфат полностью не будет преобразован в нуклеиновые кислоты и другие продукты обмена, образование тетрациклина не происходит. Также в среде необходимо присутствие катионов микроэлементов (Со, Си, Zn, Mn, Fe).

Примерный состав питательных сред: крахмал (зерно в перемолотом и набухшем состоянии) 2-5 %, сахароза (в виде сахара или свекольной патоки) 1-3 %, мука из масличного семени (отходы с низким содержанием жиров, арахис или соя) 1-3 %, мясные отходы (кровяная или мясная мука) 0,2-0,5 %, кукурузный экстракт 0,2- 1,0 %, аммониевые соли 0,1-0,5 %, известь 0,5 %, поваренная соль 0,1-0,5 %, соли микроэлементов.

Для ферментации желательно применять ферментаторы, изготовленные из нержавеющей стали или другого стойкого материала. В течение четырех дней, пока длится процесс, среда должна аэрироваться. Окончательное значение выхода продукта приближается к 1 %. Препарат может быть осажден добавлением извести до рН 8,8. Затем он отфильтровывается на фильтр-прессе, экстрагируется разбавленной кислотой и очищается посредством фракционного осаждения: после перекристаллизации можно получить продукт, достигающий 98 % чистоты.

Окситетрациклин был впервые изготовлен в 1950 г. при культивировании актиномицета Streptomyces rimosus. Среда и условия ферментации подобны используемым при производстве хлортетрациклина, за тем исключением, что в качестве источника азота могут быть использованы нитраты и кукурузный экстракт.

Окситетрациклин образует нерастворимый комплекс с солями четвертичного аммониевого основания, и этот комплекс может быть легко отделен от субстрата, после чего его размягчают соляной кислотой и затем кристаллизуют в виде соли уксусной кислоты. Как и другие тетрациклины, этот препарат выпускается главным образом в виде таблеток или суспензии.

Тетрациклин был получен после хлортетрациклина и окситетрациклина, причем почти одновременно как путем направленной ферментации с помощью отобранных штаммов Streptomyces aureofaciens в условиях низкого содержания хлоридов в питательной среде, так и путем каталитического восстановления хлортетрациклина.

В методе направленной ферментации используется ряд организмов, в том числе и Streptomyces vicidifaciens, при этом полученный штамм в адекватной среде может обеспечить большие выходы тетрациклина или равные количества хлортетрациклина и тетрациклина пропорционально количеству присутствующих ионов хлора. В случаях, когда необходимо избежать образования хлортетрациклина, содержание хлорида в среде не должно превышать 17 ч./млн.

Если необходимо использовать в качестве основных компонентов субстрата сложные биологические вещества, то в условиях промышленного производства для контроля уровня хлоридов имеются два способа:
1) удалять большую часть хлорида, пропуская компоненты, такие, как сахар-сырец и кукурузный экстракт через ионообменные смолы. Этот метод вполне эффективен, если применяется к разбавленным растворам;

2) вводить в среду вещества, замедляющие утилизацию хлорида, например, бромиды. Оказалось, что при концентрациях от 10 до 350 ч./млн., ионы брома практически подавляют образование хлортетрациклина, даже в присутствии ионов хлора в концентрациях 1500 ч./млн. На практике применяют бромистый натрий (5 %).

Получение антибиотиков-макролидов

Большую группу антибиотиков (эритромицин, олеандомицин и др.), содержащих в своей структуре макроциклический лактонный фрагмент и продуцируемых различными штаммами Streptomyces., составляют так называемые макролиды.

Наиболее известным представителем этой группы является эритромицин, который по спектру антибактериального действия близок к пенициллину и применяется для лечения больных с повышенной чувствительностью к пенициллину и тетрациклину.
Культивирование продуцента эритромицина длится 150 часов при рН~7 на среде, приготовленной на основе крахмала, соевой муки, масла, кукурузного экстракта, сухих дрожжей и извести. Культуральную жидкость фильтруют на кизельгуре, и антибиотик экстрагируют с помощью амилацетата. Обычно фильтрат культуры и растворитель пропускают через установленный в системе смеситель, а затем через обычную центрифугу. Антибиотик можно разбавить буферным раствором, осадить ацетоном и хлористым натрием, и, наконец, кристаллизовать его из ацетонового раствора.

Широкое и успешное использование антибиотиков в медицине привело к их использованию и в других областях, в том числе:
- в ветеринарии (с теми же целями, что и в медицине);
- для борьбы с некоторыми болезнями растений бактериального и грибкового происхождения;
- в качестве добавки к кормам животных, так как они ускоряют рост и увеличивают степень превращения кормов в мясо;
- в качестве консервантов скоропортящихся продуктов;
- для подавления бактериальной флоры при осуществлении различных процессов при производстве вакцин.

Наука об антибиотиках продолжает быстро развиваться. С одной стороны, продолжаются поиски новых, еще более эффективных препаратов биотехнологии, в том числе с иммуностимулирующим, противоопухолевым, противовирусным действием, с другой стороны, расширяются работы по химическому синтезу производных этих веществ и химической модификации природных антибиотиков.

Продолжаются работы по созданию новых и совершенствованию действующих процессов биотехнологии, предусматривающих создание экологически чистых безотходных технологий.

Развитие исследований в этом направлении и внедрение их в практику является одним из перспективнейших разделов естествознания.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик