Диагностика стероидных гормонов. Методы

Видео: Современные методы диагностики и лечения заболеваний печени

Для точного измерения малых концентраций стероидных гормонов и их метаболитов используют иммуноанализ методом конкурентного торможения иммунопреципитации, или радиоиммуноанализ (РИА), который был впервые описан Ялоу и Берсоном в 1960 г.. Однако при дальнейшей разработке этой методики ученые столкнулись с некоторыми трудностями. Во-первых, стероиды неиммуногенны и имеют сходную структуру — циклопентан-гаптеновое ядро с небольшими вариациями, что делает затруднительным производство специфических антител.

Стероиды можно сделать иммуногенными, присоединив к ним белок-переносчик гаптен, а уровень антител можно повысить предварительной иммунизацией гаптенами. Однако участок стероида, к которому конъюгируется белок, оказывает существенное влияние на специфичность образующихся антител. Так, антитела, образующиеся при конъюгации альбумина сыворотки быка в положении 19 демонстрируют более высокую специфичность по сравнению с положениями 3 или 17. Для более точной клинической интерпретации необходимо располагать данными по перекрестной реактивности каждого антитела, выбранного для данного анализа.
Большинство фирм — производителей реагентов предоставляют данные по перекрестной реактивности своих антител, но они не всегда надежны и должны перепроверяться той лабораторией, которая будет проводить анализ.

Во-вторых, высокоаффинные связывающие белки, находящиеся в сыворотке крови, такие как ПГСГ, конкурируют с антителами и таким образом создают помехи для определения количества стероидных молекул с помощью РИА. Это приводит к трудностям для прямого измерения и требует предварительной экстракции стероида органическими растворителями, а зачастую и его хроматографической сепарации. В то же время некоторые химикаты, например 8-анилинонафталенсульфонат, способны ингибировать связывание стероида с белками, что позволяет напрямую измерить концентрацию стероида без предварительной экстракции.

Видео: Современные безвредные методы диагностики стопы и позвоночника в ортопедическойм центре «Юлианна»

Прямой анализ занимает мало времени и может быть автоматизирован. В продаже имеются автоматизированные блоки для определения концентрации эстрадиола, прогестерона и тестостерона, которые используются во многих лабораториях. Такие анализы, однако, характеризуются слабой чувствительностью, а при определении минимальных концентраций — низкой надежностью. В связи с этим их не рекомендуется применять при определении чрезвычайно малых концентраций гормона, например эстрадиола у детей и мужчин (<100 пг/мл), тестостерона у детей и женщин (<1,5 нг/мл) [64] и прогестерона во время стимуляции яичников (<1 нг/ мл).

Проблема может быть решена с помощью экстракции сыворотки гексанэтилацетатом (в объемном соотношении 3:2) с последующим ее высушиванием и восстановлением в бесстероидной сыворотке, которая затем подвергается анализу на автоматическом блоке.

Применение газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС) позволяет преодолеть многие недостатки иммуноанализа и считается более надежным и точным методом. Однако ГХ/МС проводится в несколько этапов, включая экстракцию растворителя, хроматографическое разделение и химическую интерпретацию, которые предшествуют инструментальному анализу, а чувствительность ГХ/МС часто оказывается более низкой, чем у некоторых разновидностей иммуноанализа. В последнее время эта методика вытесняется жидкостной хроматографией в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ/ТМС), характеризующейся более высокой чувствительностью и производительностью по сравнению с ГХ/МС.

Теперь эта новая технология считается эталонной. ЖХ/ТМС использовали для одновременного измерения уровней эстрадиола и эстрона в плазме крови человека без перекрестной реактивности. Указанные методы могут быть рекомендованы в качестве референтных и использоваться для стандартизации и одобрения иммуноаналитических исследований, которые обеспечивают необходимую для клинических нужд простоту и высокую пропускную способность.

Источник: http://meduniver.com