Разработка и использование метода серотипирования для определения циркулирующих генотипов вируса гепатита с.

Вирус гепатита С (ГС) относится к возбудителямс чрезвычайно выраженной гетерогенностью популяции. Установлено,что пациенты с хроническим ГС, ассоциированным с различными генотипамивируса, по разному отвечают на интерферонотерапию.Определениегенотипов вируса ГС важно при проведении эпидемиологических исследований,так как позволяет хорошо документировать передачу возбудителя.

Цель настоящего исследования - оценить возможностиметода серотипирования для определения генотипов вируса ГС. Длясеротипирования был адоптирован оригинальный метод, описанныйгруппой исследователей из Великобритании под руководством P.Simmonds(1993,1995). 12 коротких пептидов (18-19 аминокислотных остатков),представляющих эпитопы NS4 белка 6 генотипов вируса ГС, были полученыметодом твердофазного синтеза, очищенны с помощью высокоэффективнойжидкостной хроматографии и использованы в качестве основы иммуносорбентадля проведения иммуноферментного анализа с сыворотками содержащимиантитела к NS4 белку (анти-NS4). Наличие анти-NS4 подтверждалосьв ИФА со смесью пептидов для серотипирования или методом иммуноблоттинга( LiaTek HCV, Organon Teknika- Wellcozyme HCV Western Blot, Murex).

Специфичность определения генотипов вируса ГС разаработаннымвариантом серотипирования изучена при сопоставлении результатов“слепого” тестирования панели сывороток из 154 анти-NS4-позитивныхобразцов с известными генотипами вируса (за исключением 1 образца),определенными с помощью RFLP по методике описанной P.Pohjanpeltoet al. (1996) на кафедре вирусологии Хельсинского университета.

Для изучения особенностей распространения вариантоввируса ГС на некоторых территориях России (Санкт-петербург, НижнийНовгород, Уфа, Белгород) и сопредельных стран (Белоруссия, Казахстан,Грузия) методом серотипирования были тестированы анти-NS4-позитивныесыворотки, полученные от 474 человек, включая 157 доноров крови,237 больных гепатитом С и 80 лиц из групп риска ( внутривенныенаркоманы, онкогематологические больные, пациенты центров хроническогогемодиализа, туберкулезных стационаров и др.).

Результаты “слепого” тестирования 154 сыворотокс известными генотипами вируса гепатита С по RFLP представленыв таблице №1 . В целом серотипировано 148 образцов (96,1%). Полноесовпадение серо- и генотипов наблюдалось в 130 сыворотках из 148(87,8%). Для отдельных генотипов этот показатель оказался различным.Наибольшая частота совпадения результатов отмечена для HCV-1 -(92,5%) с разбросом показателя от 87,1% для сывороток субтипа1в до 100% для сывороток со смешанными субтипами 1а+1в- для HCV-3- 94,3% (все сыворотки относились к субтипу 3а). Наименьший процентсовпадения результатов наблюдался при тестировании сывороток,относящихся по RFLP к генотипу HCV-2 (80%). При серотипированиибыло обнаружено 5 сывороток, которые можно было отнести к генотипуHCV-4. Однако при сравнении результатов с данными RFLP совпадениеотмечено только в 2-х пробах (40%).

Высокая корреляция результатов определения генотиповвируса ГС, полученных двумя совершенно разными методами, позволилаиспользовать серотипирование для изучения циркуляции вариантоввируса ГС на отдельных территориях. Результаты этой части исследованийсуммированы в таблице №2. В целом на всех изученных территорияхвыявлена циркуляция 3 генотипов вируса ГС, в единичных случаяхв четырех регионах определен генотип HCV-4. Наиболее часто определялсягенотип HCV-1 (от 47,1% в сыворотках из Грузии до 74,4% - из Белоруссии).Второе ранговое место по частоте выявления занимал практическина всех территориях генотип HCV-3 (от 15,5% в сыворотках из Белоруссиидо 34,0% - из Нижнего Новгорода). Значительно реже изученные сывороткисодержали типоспецифические анти-NS4 HCV-2. Максимальная частотавыявления этого генотипа была установлена в сыворотках из Белоруссии(12,7%), Казахстана (13,7%), а минимальная - в сыворотках из Санкт-Петербурга(3,8%). В 35 сыворотках, представляющих все изучаемые регионы,при серотипировании было установлено наличие анти-NS4 разных генотипов(смешанные генотипы). Наибольшую долю среди сывороток со смешаннымигенотипами составили образцы в которых одновременно определялисьHCV-1 и HCV-3 (26 из 35 - 74,3%), т.е наиболее часто встречающиесягенотипы. Остальные варианты сочетаний встречались значительнореже - HCV-1+HCV-2 (8,6%), HCV-2+HCV-3 (11,4%). Сочетание HCV-1+ HCV-4 выявлено в двух сыворотках из Грузии (5,7%).

Материалы настоящего исследования свидетельствуюто том, что использование синтетических пептидов, соответствующихантигенным детерминантам неструктурного белка NS4, в качествеосновного компонента иммуносорбента для ИФА позволяет успешноопределять генотипы вируса ГС в сыворотках инфицированных этимвозбудителем людей и проводить мониторинг за циркуляцией геновариантоввозбудителя в регионах.

Для определения генотипов вируса ГС также использованметод ПЦР-RFLP с типоспецифическими рестрикционными ферментамиBst U1 и Bst N1 и последующим анализом продуктов рестрикции спомощью горизонтального электрофореза в 3% геле агарозы (ThiersV. et al., 1997). Этим методом протестированы сыворотки крови15 больных хроническим ГС, получавших интерферонотерапию. РНКвируса ГС выявлена в 14 образцах, при этом в 6 случаях (42,9%)установлен субгенотип 3а, в 3 (21,4%) - гентип 1 ( 2- субгенотип1в: 1 - субгенотип 1а). РНК вируса ГС, выделенная из 4 образцовотносилась к редко выявляемым генотипам возбудителя - 4/5. Последниенаходки требуют дальнейшего тщательного изучения.

Таблица 1. СОПОСТAВЛЕНИЕ PЕЗУЛЬТAТОВ ОПPЕДЕЛЕНИЯГЕНОТИПОВ ВИPУСA ГЕПAТИТA С МЕТОДAМИ RFLP И СЕPОТИПИPОВAНИЯ

ГЕНОТИПИPОВAНИЕ (ПЦP-RFLP)		СЕPОТИПИPОВAНИЕ
			HCV-1	HCV-2	HCV-3	HCV-4	НТ*	ВСЕГО
HCV-1	1a			1	1	;	;	31/20.8
	1a+1b		29	;	;	;	;	6/3.9
	1b		27	2	;	2	2	33/21.4
	Итого		62	3	1	2	2	70/46.1
HCV-2	2a		;	3	;	;	;	3/1.9
	2b		1	13	4	1	1	20/13.0
	Итого		1	16	4	1	1	23/14.9
HCV-3	3a		2	1	50	;	2	55/35.7
HCV-4	4c		2	;	;	2	;	4/2.7
ВСЕГО**	НТ		;	;	1	;	;	1/0.6

ПPИМЕЧAНИЕ: * - не типиpовaлось **- aбс.число/пpоцент

Таблица 2. ЧAСТОТA ВЫЯВЛЕНИЯ PAЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВВИPУСA ГЕПAТИТA С МЕТОДОМ СЕPОТИПИPОВAНИЯ НA ОТДЕЛЬНЫХТЕPPИТОPИЯХ PОССИИ И СОПPЕДЕЛЬНЫХ СТPAНAХ

Территория	Всего исследованосывороток	Генотипы вируса гепатита С (ПО P.SIMMONDS)*
		1	2	3	4	микст
Сaнкт-Петеpбуpг	79	45/57.0	3/3.8	23/29.1	1/1.3	7/8.9
Нижний Новгоpод	47	23/49.0	4/8.5	16/34.0	;	4/8.5
Уфa	19	8/42.1	1/5.3	9/47.4	;	1/5.3
Белгоpод	66	38/57.6	5/7.6	19/28.8	2/3.0	2/3.0
Белоpуссия (Минск,Витебск)	71	50/70.4	9/12.7	11/15.5	;	1/1.4
Кaзaхстaн (Aлмaты)	124	67/54.1	17/13.7	26/20.9	1/0.8	13/10.5
Гpузия (Тбилиси)	68	32/47.1	7/10.3	19/27.9	3/4.4	7/10.3
ИТОГО	474	263/55.5	46/9.7	123/25.9	7/1.5	35/7.4

ПPИМЕЧAНИЕ: * - aбс.число сывоpоток с дaнным генотипом/% (нa 100 сывоpоток с укaзaнной теppитоpии)

Литература:

1. 1.Pohjanpelto P.,Lappalainen M.,Widell A. et al.// Clin.Diagn.Virol.-1996. -Vol.7. -P. 7-16
2. 2.Simmonds P.,Holmes E.C.,Cha T.A. et al.// J.Gen.Virol.-1993.-Vol.74.-P. 2391 -2399