Эндокринология влияние ферментов протеолиза на метаболическую активность клеток головного мозга и нейтрофильных лейкоцитов белых крыс

Известно, что протеолитические ферменты ( трипсин,химотрипсин и другие ) в ряде случаев оказывают выраженное противовоспалительноедействие. В связи с этим, ферменты-протеазы сравнительно широкоиспользуются для лечения различных групп воспалительных заболеваний:бронхо-легочных, гинекологических, стоматологических, опухолевыхпроцессов (2,7,14), а также в профилактике воспаления в хирургии(6). Между тем механизмы профилактического и лечебного действияпротеолитических ферментв при воспалительных процессах остаютсянедостаточно изученными. Наиболее полно освещена и аргументированав литературе роль некро- и фибринолитического (тромболитического)эффектов протеаз в их противовоспалительном действии (5,6). Однаков литературе мало данных о прямом влиянии протеаз на метаболическуюактивность клеток организма.

Целью работы явилось экспериментальное исследованиевлияния трипсина и калликреина на активность ферментов аэробногоокисления в нервных клетках и макрофагах, играющих ведущую рольв предупреждении воспалительного процесса (гематоэнцефалическийбарьер).

Материалы и методы.

Эксперименты проведены на 61 белых крысах-самцах популяции Вистармассой 200-250 г. Выполнено 10 серий опытов: 6 серий - контрольных,у которых изучена активность дегидрогеназ в нейтрофильных лейкоцитахи в системе "нейроцит-нейроглия" коры головного мозгаинтактных животных, при внутрибрюшинном введении 0,85% растворахлористого натрия, инактивированного трипсина и калликреина (39крыс)- 4 серии - опытных, в которых изучены активность дегидрогеназнейроцитов при внутрибрюшинном введении активного трипсина и калликреина,а также активность дегидрогеназ и содержание гликогена в нейтрофильныхлейкоцитах крыс при внутрибрюшинном введении исследуемых активныхферментов (24 животных). Исследуемые препараты вводились из расчета50 мкг на 100 г массы животного. Изучение метаболизма нервныхклеток коры головного мозга нейтрофильных лейкоцитов крыс осуществлялиспустя 6 часов после внутрибрюшинного введения исследуемых препаратов.Результаты опытов представлены в таблицах N1 и N2.

При гистохимическом исследовании объектом изученияслужил участок головного мозга крыс, взятый в области левой переднейцентральной извилины. Для гистохимического анализа готовили криостатныесрезы толщиной 15 мкм при -20oС на микротоме- криостатеМК-25 по общепринятой методике [9]. В клетках коры головного мозгакрыс выявляли активность лактатдегидрогеназы, глицерофосфатдегидрогеназыпо методике Гесса, Скарпелли, Пирса [9] и сукцинатдегидрогеназыпо методике Нахласа [8]. Об активности дегидрогеназ судили поконцентрации гранул формазана в срезах исследуемых объектов. Контрольспецифичности гистохимического выявления активности дегидрогеназпроводили на криостатных срезах ткани мозга, которые инкубировалив рабочих растворах при отсутствии в нем специфических субстратовокисления. Учет гистохимической реакции на дегидрогеназы осуществлялис помощью цитофотометра при длине волны 512 нм, диаметр зонда0,1 см, объектив 40 [1]. Оценку чисто химических реакций оценивалив единицах оптической плотности. При определении активности дегидрогеназв нейрофильных гранулоцитах крови белых крыс исследовали активностьСДГ [15], ЛДГ и ГФД по методу Гесса и соавт.[8] в модификации,предложенной Борисовой М.А. и соавт. [3,4]. Цитохимическое выявлениегликогена в нейтрофильных лейкоцитах проводили по методу Хочкиса-Шабадаша[11,13]. Окончательную оценку цитохимической реакции осуществлялипо принципу Kaplow L. [14]. Нейтрофильные лейкоциты в зависимостиот степени активности ферментов классифицировали:
1 степень - в цитоплазме содержатся единичные гранулы формазана.Активность фермента незначительна (рис.1а).
2 степень - гранулы формазана занимают менее половины цитоплазмыклеток. В эту группу входят клетки, содержащие мелкие (пылевидные)включения, либо очень бледно окрашенную диффузную массу (рис.1б).
3 степень - лейкоциты с выраженными включениями продуктов реакции,занимающие более половины цитоплазмы нейтрофильных лейкоцитов(рис.1в).
4 степень - клетки с выраженными включениями продуктов реакции,занимающими всю цитоплазму нейтрофильных лейкоцитов. Активностьфермента высокая (рис.1г). Результаты исследований обрабатывалиметодами вариационной статистики.

Результаты и обсуждение.



Внутрибрюшинное введение крысам трипсина иликалликреина вызывало повышение в нейроцитах и клетках нейроглиибольших полушарий головного мозга активности фермента аэробногоокисления - СДГ на 27,2% (р < 0,001), на 18,2% (р < 0,002)соответственно. Активность ЛДГ в изучаемых клетках больших полушарийголовного мозга под действием трипсина и калликреина снизиласьна 27,8% (p < 0,025) и на 16,3 (р < 0,001) соответственно.Активность ГФД в нейроцитах и клетках нейроглии больших полушарийголовного мозга снизилась на 26,0% (р < 0,01) только под действиемтрипсина. Введение калликреина также вызвало уменьшение данногоцитохимического показателя на 5,3% (р < 0,05).

Результаты проведенного исследования обобщеныи представлены в таб. N1.
Влияние трипсина и калликреина на активность дегидрогеназ в системенейроцит-нейроглия коры головного мозга крыс in vivo(М+/-m).

Препараты, вводимые крысам на 100 г массыИзучаемые гистохимические показатели
СДГЛДГГФД
1. Интактные крысы n= 121,94+/-0,051,46+/-0,041,29+/-0,08
2. 0,85% р-р хлористого натрия - 1,5 мл n=51,96+/-0,251,46+/-0,021,25+/-0,08
3. Инактивированный трипсин - 50 мкг n=51,8+/-0,11,37+/-0,011,31+/-0,08
4. Инактивированный калликреин - 50 мкг n=51,98+/-0,081,54+/-0,021,34+/-0,12
5. Активный трипсин 50 мкг n=52,29+/-0,05
+27,2%
*****		0,99+/-0,15
-27,8%
**		0,97+/-0,02
-26,0%
****
6. Активный калликреин - 50 мкг n=52,34+/-0,04
+18,2%
****		1,29+/-0,05
-16,3%
*****		1,27+/-0,05
-5,3%
*



Примечание: в числителе - активность дегидрогеназв условных единицах- в знаменателе - изменение показателя в процентахпо отношению к контролю. Для серии опытов N3,4 - контрольной являетсясерия N2. Для серии N5- серия N3. Для серии N6 - серия N4. ( *)- р < 0,05- (**) - р < 0,025- (***) - р < 0,01- (****)- р < 0,002- (*****) - р < 0,01.

Сопоставление данных гистохимического исследованиямета-болической активности клеток головного мозга и крови белыхкрыс при действии изучаемых протеаз выявило одинаковую направленностьизучаемых показателей. Парентеральное введение животным трипсинаи калликреина в дозе 50 мкг на 100 г массы тела вызывало существенныйсдвиг метаболизма в системе и нейроцит-нейроглия и коры головногомозга и в нейтрофилах в сторону усиления аэробных окислительно-восстановительныхпроцессов, о чем наглядно свидетельствовало увеличение активностиСДГ, ключевого фермента окислительного фосфорилирования. Учитываяпрямое кининогеназное действие в крови трипсина и калликреина[12], можно предположить, что выявленные нами цитохимические измененияв клетках коры больших полушарий головного мозга крыс обусловленыбиологическим действием кининов, которые, вероятно, проникаютчерез гематоэнцефалический барьер и стимулируют в нервной тканиаэробные окислительно-восстановительные процессы.

Снижение активности ЛДГ-ключевого фермента аэробногоокислительного фермента в клетках головного мозга и крови белыхкрыс при действии трипсина свидетельствует о том, что этот ферментпри парентеральном введении угнетает гликолиз в клетках с различнойфункциональной специфичностью.

Известно, что по сравнению с большинством другихклеток организма во всех лейкоцитах гликолитическое превращениеуглеводов превалирует над окислительным фосфорилированием. Удельныйвес гликолиза составляет более 60% в общей сумме энергетическихпроцессов [10].

Таблица 2.
Изменения активности дегидрогеназ и содержания гликогена в нейтрофильныхлейкоцитах белых крыс под действием трипсина и калликреина (М+/-m)- (в условных единицах активности по Kaplow)

Серия
опытов		Характер
воздействия		Изучаемые цитохимические показатели(усл.ед.)
СДГГФДЛДГГликоген
1. n=6Контроль170,0+/-4,0197,0+/-2,0195,5+/-10,0252,0+/-5,0
2. n=6Физ.раствор171,0+/-3,0198,0+/-3,0196,5+/-5,0257,0+/-2,0
3. n=6Трипсин195,0+/-3,0164,0+/-3,0166,0+/-3,0206,0+/-4,0
4. n=6Калликреин209,0+/-3,0160,0+/-2,0156,0+/-1,0212,0+/-2,0

Примечание: в каждой серии исследованийи в контроле использовано по 6 животных. Достоверность различий:р < 0,001.

  1. Парентеральное введение малых доз трипсина, наряду с хорошоизученными лечебными свойствами, угнетает анаэробный энергетическийобмен нейтрофилов, тормозить процесс миграции лейкоцитов в очагвоспаления и тем самым препятствует распространению воспалительногопроцесса.
  2. Действие малых доз трипсина увеличивает антитриптическую активностьгомогената больших полушарий головного мозга крыс и имеет выраженныйлечебный антивоспалительный эффект.
  3. Малые дозы калликреина, подобно малым дозам трипсина, снижаютактивность ЛДГ и ГФД в нейтрофильных лейкоцитах и стимулируютантитрипсинолитическую активность гомогената головного мозгакрыс, что позволяет калликреин в малых дозах, так же как и трипсин,применять в качестве противовоспалительного средства.

Список литературы

  1. Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофотометрия: аппаратура и методыанализа клеток по светопоглощению. - Ленинград. Наука, 1979.- 259 с.
  2. Баумхакл У., Фодемар С., Крейчова Х. Энзимотерапия острыхи хронических воспалительных процессов в кн: Системная энзимотерапия:исследования и клиническая практика. Под редакцией К.Ноуза,З. Масиновски, Р. Ноуза. - Мюнхен. - Прага. - 1994. - С. 27-30.
  3. Борисова М.А., Овчаренко Н.И., Спахов А.С. Некоторые суправитальныеспособы цитохимического определения активности лактатдегидрогеназыи сукцинатдегидрогеназы в клетках крови // Лаб. дело. - 1975.- N 12. - С. 723-725.
  4. Борисова М.А., Овчаренко Н.И.,Шпак С.И., и соавт. Суправитальныеспособы цитохимического определения активности альфа-глицерофосфатдегидрогеназыи глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в лейкоцитах периферическойкрови // Лаб. дело. - 1983. - N 9. - С. 8-10.
  5. Веселов В.Ф., Проценко В.А. Влияние ферментов протеолиза иих ингибиторов на поглощение кислорода тканью мозга крыс и ееантитриптическую активность // Укр. биохим. журн. - 1981. -N 4. - С. 106-108.
  6. Вольф М., Рансберг К. Лечение ферментами. - Москва: Мир, 1976.- 233 с.
  7. Диттмар Д.Ф. Аднексит в кн: Системная энзимотерапия: исследова-нияи клиническая практика. Под редакцией К. Ноуза,З. Масиновски,Р. Ноуза. - Мюнхен. - Прага. - 1994. - С. 35-36.
  8. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. Москва: Иностр.литер., 1962.- 962 с.
  9. Федоров Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция. - Москва:Медицина, 1976. - 543 с.
  10. Шабадаш А.Л. Цитологические и цитохимические представленияо барьерных механизмах в клетках. Труды совещания в кн: Гисто-гематическиебарьеры. - Москва: Наука, 1961. - С. 381-394.
  11. Hamberg U. Influences on the kinin system by proteolysis inplasma // Proc. Roy. Sol. - London, 1969. - V. 173. - N 1032.- P. 393-406.
  12. Hotchkiss R.D. A microchemical reaction resalting in the staimingof polysaccharide structures in fixed yissue preparations //Arch. Biochem. - 1948. - V.16. - P. 131-141.
  13. Kaplow L. A histochemical procedure for localising an evacuatingleucocyte alcaline phasphatase activity in Smears of blood marrow// Blood. - 1955. - V.10. - P. 1023-1029.
  14. Klashka F. Oral enzimes - new approach to cfncer tritment// Forum. - Med. - Verl. - Ges. - 1996. -V.2.- Р. 102.
  15. Quglino D., Hayhol F. Acetone fixation for the cytochemicaldemonstration of dehidrogenase in blood and bone marrow ctlls// Nature.- 1960. -V.1.- P. 85-86.
  16. Sokolova A. Behandlung des multiplen myeloms mit enzimen //Wzarba Y., Klein M.-W., Miehlke et al. ( eds.). Sistemischeenzymtherapie. Aktueller stand and Fortschritte. - MMW MedizinVerlag. - Munchen. - Germany. - 1996.
95000 г. Симферополь
Бульвар Ленина 5/7
Крымский медицинский университет
Кафедра патологической физиологии
Ассистент кафедры – Грановский Александр Анатольевич
Тел: 0652-29-49-40
E-mail:[email protected]


Похожее