Метод поляризации флюоресценции антител. Корреляция иммуноглобулинов

Для решения вопроса о существовании независимого вращения субъединиц иммуноглобулинов большую помощь оказал метод поляризации флюоресценции. Основной подход, который использовался в этих опытах по изучению гибкости иммуноглобулинов, заключался в сравнении экспериментально определяемого времени корреляции молекулы иммуноглобулина, характеризующем найденное в опыте время выхода молекулы из плоскости поляризованного света, с временем корреляции, рассчитанным исходя из предположения о жесткости молекулы.

Так, если считать молекулу IgG жестким эллипсоидом вращения с соотношением осей 1:2 и молекулярным весом 150 000, время корреляции этой молекулы должно быть равным 73 нсек, а экспериментально наблюдаемое, как правило, было значительно меньшим: 20—40 нсек. Это указывает на способность фрагментов к независимому относительному перемещению и, следовательно, на гибкость связывающих их участков полипептидных цепей. Сходные данные были получены с помощью спиновых меток.

Стайер и Грифит (Stryer, Griffith, 1965) для определения времени корреляции спин-меченого гаптена, связанного с антителом, изучали поведение вещества, содержащего одновременно как флуорохромную группировку, так и спиновую метку в растворах различной вязкости.

Изменяя вязкость раствора добавлением глицерина, добивались совпадения его спектра ЭПР со спектром спин-меченого гаптена, связанного с активным центром. Затем методом поляризации флуоресценции определяли время корреляции. Найденное таким образом время корреляции N—О-группы связанного спин-меченого гаптена оказалось равным 12 нсек. При этом авторы справедливо отмечают, что это значение может быть занижено по сравнению с временем корреляции Fab-фрагмента, так как нельзя исключить возможность вращения имминоксилыюго кольца относительно динитрофенильной группы, жестко связанной с активным центром. Этот недостаток является общим для всех попыток определить время корреляции Fab-фрагмента IgG, используя спин-меченый гаптен.

">

Хсиа и Пиетт (Hsia, Piette, 1969) для определения времени корреляции связанного с активным центром спин-меченого гаптена строили калибровочную зависимость спектров ЭПР от вязкости раствора спиновой метки. Время корреляции, соответствующее тому или иному спектру, определяли по закону Стокса — Эйнштейна, считая, что эффективный радиус Стокса метки равен 5 А. Самый короткий спин-меченый гаптен, наиболее жестко связанный с активным центром, имел время корреляции 39 нсек.

Двек и соавторы (Dwek е. а., 1975а) рассчитали время корреляции спин-меченого ДНФ, локализованного в активных центрах IgA (МОРС 315) и его Fab- и Fv-фрагмснтов. Оно оказалось равным 44,4, 23 и 6,5 нсек соответственно.

Получены кроличьи антитела непосредственно против спиновой метки 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-4-амино (N-дихлортриазина), служившей при иммунизации гаптеном. Результатом образования специфических комплексов антител, их пепсиновых и папанновых фрагментов со спиновой меткой была ее сильная иммобилизация. Смешивание соответствующих количеств растворов неспецифических кроличьих IgG и метки в аналогичных условиях приводило лишь к появлению спектра ЭПР свободной метки. Время корреляции меток рассчитывали по Шимшику и Мак-Коннелу (Shimshick, McConnell, 1972). Для комплексов спиновой метки с антителами, Fc- и Fab-фрагментами в области изоэлектрической точки (рН 6,3) оно оказалось равным 32, 30 и 18 нсек соответственно.
Полученные нами значения времени корреляции для IgG и Fab-фрагментов подтверждаются в упомянутой работе.

Различия во времени корреляции, полученные для Fab-фратмента, как изолированного, так и входящего в состав F(ab)2 и интактного антитела указывают на ограничения свободы вращения Fab-фрагментов, накладываемые взаимодействием субъединиц F(ab)2 и IgG. Повышение температуры приводило к уменьшению приведенного к стандартным условиям (3*105 П/°С) времени корреляции комплексов метки с F(ab)2 и IgG.

По-видимому, при нагревании свобода относительно перемещения их субъединиц возрастает. Возможность получения антител к спиновой метке, служившей при иммунизации гаптеном, подтверждена в другой работе (Humphries, McConnell, 1976).

Источник: http://meduniver.com